稳定缺氧诱导因子-1α表达对1型糖尿病心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌细胞线粒体自噬的影响
夏夏，夏中元
基金项目
摘要：目的观察1型糖尿病心肌缺血再灌注损伤（ischemia-reperfusion injury，IRI）大鼠稳定缺氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）表达情况，探讨其对心肌细胞线粒体自噬的影响及可能机制。 方法SD大鼠32只，随机分为假手术组、IRI组、稳定HIF-1α组、自噬抑制组各8只。4组大鼠均腹腔注射质量分数1%链脲佐菌素柠檬酸盐缓冲液60mg/kg制备1型糖尿病模型，造模成功后8周，IRI组、稳定HIF-1α组、自噬抑制剂组结扎左前降支30 min后松开结扎线再灌注2h，制备IRI模型；假手术组只穿线不结扎。再灌注前1h，稳定HIF-1α组腹腔注射HIF-1α表达稳定剂二甲基草酰甘氨酸40mg/kg，自噬抑制剂组腹腔注射二甲基草酰甘氨酸40mg/kg+自噬抑制剂3-甲基腺苷10 mg/kg，假手术组、IRI组腹腔注射等量生理盐水。再灌注2h，采用ELISA法检测4组血清肌酸激酶同工酶（creatine kinase-MB，CK-MB）、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）水平；处死大鼠，采用TTC法检测心肌梗死面积，HE染色观察心肌组织病理改变，采用Western blot法检测心肌组织微管相关蛋白B轻链3-Ⅱ（microtubule-associated protein 1 light chain 3-Ⅱ，LC3-Ⅱ）、Bcl-2相互作用蛋白3（Bcl-2 ineracting protein 3，BNIP3）、HIF-1α蛋白相对表达量。 结果再灌注2h，IRI组、稳定HIF-1α组、自噬抑制组心肌梗死画积[（43.92±7.34）%、（25.71±4.65）%、（39.24±6.43）%]、血清CK-MB水平[（801.32±86.54）、（512.61±52.32）、（721.42±77.32）u/L]及LDH水平[（621.12±69.13）、（400.23±39.45）、（599.32±55.45）u/L]均高于假手术组[0、（452.12±49.34）u/L、（350.43±37.24）u/L]（P<0.05），且IRI组、自噬抑制组高于稳定 HIF-1α组（P<0.05），IRI组高于自噬抑制组（P<0.05）。再灌注2h，假手术组心肌结构正常，纤维组织无肿胀、紊乱，间质少量炎症细胞浸润；IRI组、稳定HIF-1α组、自噬抑制组心肌纤维间质组织肿胀，下突肌松，大量炎症细胞浸润，IRI组病变最严重，自噬抑制组次之，稳定HIF-1α组较轻。再灌注2h，IRI组、稳定HIF-1α组、自噬抑制组心肌组织HIF-1α蛋白相对表达量（1.53±0.13、2.50±0.23、1.73±0.14）、LC3-Ⅱ相对表达量（1.48±0.12、2.43±0.21、1.65±0.15）、BNIP3蛋白相对表达量（1.40±0.09、2.32±0.19、1.67±0.13）均高于假手术组（1.00±0.00、1.00±0.00、1.0±0.00）（P<0.05），稳定HIF-1α组、自噬抑制组高于IRI组（P<0.05），稳定HIF-1α组高于自噬抑制组（P<0.05）。 结论稳定HIF-1α表达可能通过促进心肌组织LC3-Ⅱ、BNIP3表达增强心肌细胞线粒体自噬，发挥对1型糖尿病大鼠缺血IRI心肌的保护作用。
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关键词：1型糖尿病；心肌缺血再灌注损伤；自噬；缺氧诱导因子-1α；大鼠
通信作者：夏中元，E-mail：xiazhongyuan2005@aliyun.com。
糖尿病心肌缺血再灌注损伤（ischemia-reperfusion injury，IRI）较非糖尿病心肌IRI加重，其机制与氧化应激、钙超载及自噬紊乱等有关。缺氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）是异二聚体转录因子，是细胞在低氧条件下反应的关键调节因子，在保护心肌免受低氧应激中起核心作用 [1] 。研究 [2] 证实，心肌细胞过表达HIF-1α对成年大鼠离体缺血的心脏具有保护作用，其机制与增强心肌细胞自噬有关。但在常氧环境中，HIF-1α易被脯氨酸羟化酶降解失活，影响其功能，稳定HIF-1α表达可能具有心肌保护作用。本研究探讨稳定HIF-1α表达对1型糖尿病心肌 IRI大鼠心肌细胞线粒体自噬的影响及可能机制，报道如下。
1 材料与方法
1.1 一般材料
1.2 方法
1.2.1 仪器与试剂 HIF-1α、心肌组织微管相关蛋白B轻链3-Ⅱ（microtubule-associated protein 1 light chain 3-Ⅱ，LC3-Ⅱ）、Bcl-2相互作用蛋白3（Bcl-2 interacting protein 3，BNIP3）检测试剂盒（美国CST公司），HIF-1α、LC3-Ⅱ、BNIP3 兔抗鼠一抗（美国L1-COR公司），质量分数1%链脲佐菌素柠檬酸盐缓冲液肌酸激酶同工酶（creatine kinase-MB，CK-MB）、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）（美国Sigma公司），HRP标记的多克隆二抗、BCA检测试剂盒（英国Abcam公司），HIF-1α稳定剂二甲基草酰甘氨酸（dimethyloxalyl glycine，DMOG）、自噬抑制剂3-甲基腺苷（3-methyladenine，3-MA）（美国CSN pharm公司）。恒压恒流电泳仪（美国Bio-Rad公司），Odyssey双色红外激光扫描系统（美国Li-Cor公司），CX31正置荧光显微镜（日本Olympus公司）。
1.2.2 模型制备及药物处理4组大鼠禁食12h后腹腔注射质量分数1%链脲佐菌素柠檬酸盐缓冲液60mg/kg，3 d后尾静脉采血，检测血糖≥16.7mmol/L且出现多饮、多食、多尿等症状提示1型糖尿病模型制备成功。造模成功后8周，IRI组、稳定HIF-1α组、自噬抑制剂组注射质量分数1%戊巴比妥钠60 mg/kg腹腔麻醉后固定于手术台，气管插管后连接动物呼吸机，于左锁骨中线第4肋间开胸并暴露心脏，用6-0尼龙线结扎左前降支30 min.然后松开结扎线再灌注2h，用医用无菌纱布覆盖；假手术组只穿线不结扎。再灌注前1h，稳定HIF-1α组腹腔注射DMOG 40 mg/kg，自噬抑制剂组腹腔注射DMOG 40 mg/kg及3-MA 10mg/kg，假手术组、缺血再灌注组腹腔注射等量生理盐水。
1.2.3 血清CK-MB水平及LDH活性检测 再灌注2h，采集4组大鼠左心室血液5mL，离心半径8.6cm，12 000 r/min离心5min分离血清，采用ELISA法检测血清CK-MB、LDH水平，严格按试剂盒说明书进行操作。
1.2.4 心肌梗死面积检测 采用TTC法。采集血液后重新结扎左前降支，经股静脉注射质量分数1%伊文斯蓝染液1mL.至未梗死心脏区域蓝染，迅速摘取心脏并分成3份，-20℃冰箱速冻30 min。取1份心脏组织，制备厚约1 mm切片，于质量分数1%TTC 溶液中37℃避光孵育15 min，体积分数4%多聚甲醛固定15 min，红外激光扫描系统拍照。采用Image Pro Plus 6.0图形分析系统分析心肌梗死面积。正常心肌呈蓝色，缺血心肌呈砖红色，梗死心肌呈灰白色。
1.2.5 心肌组织病理检查 取1份心脏组织，切取左心室组织，甲醛固定后脱水、石蜡包埋，连续厚0.5μm切片，脱蜡水化，HE染色封片。每张切片随机选取5个视野，荧光显微镜拍照，使用Image Proplus 6.0图形分析系统观察心肌组织病理改变。
1.2.6 Western blot法检测心肌组织HIF-1α、LC3-Ⅱ、BNIP3蛋白相对表达量取1份心脏组织，充分研磨后加入RIPA裂解液裂解30 min，4℃，离心半径8.6cm，12000r/min离心5min取上清收集即为总蛋白，采用BCA法进行蛋白定量。取20μg总蛋自，加入5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液20μL，煮沸5min，进行SDS-PAGE电泳分离；采用湿转法将蛋白转移至PVDF膜；4℃、体积分数5%脱脂牛奶常温封闭1h；加入兔抗鼠一抗HIF-1α（1：1000）、LC3-Ⅱ(1:1000)、BNIP3(1:1000)、GADPH(1:1000)4℃孵育过夜；TBST溶液清洗3次，每次10 min；加入HRP标记的多克隆二抗HIF-1α（1：1000）、LC3-Ⅱ(1:1000)、BNIP3(1:1000)、GADPH（1：1000）室温孵育1h；TBST溶液清洗3次，每次3 min；Odyssey红外扫描显影仪扫描并测定条带灰度值。以GADPH为内参，计算HIF-1α、LC3-Ⅱ、BNIP3 蛋白相对表达量。
1.3 统计学处理
应用GraphPad Prism version 6.0 软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差表示，4组比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD检验；检验水准α=0.05。
2 结 果
2.1 4组大鼠血清CK-MB和LDH水平及心肌梗死面积比较
再灌注2h，IRI组、稳定HIF-1α组、自噬抑制组心肌梗死面积、血清CK-MB及LDH水平均高于假手术组（P<0.05），IRI组、自噬抑制组高于稳定HIF-1α组（P<0.05），IRI组高于自噬抑制组（P<0.05）。见表1。
2.2 4组大鼠心肌组织病理改变
再灌注2h，假手术组心肌结构正常，纤维组织无肿胀、紊乱，间质少量炎症细胞浸润。IRI组、稳定HIF-1α组、自噬抑制组心肌纤维间质组织肿胀，下突肌松散，大量炎症细胞浸润，且IRI组病变最严重，自噬抑制组次之，稳定HIF-1α组较轻。见图1。
2.3 4组大鼠心肌组织HIF-1α、LC3-Ⅱ、BNIP3蛋白相对表达量比较
再灌注2h，IRI组、稳定HIF-1α组、自噬抑制组心肌组织HIF-1α、LC3-Ⅱ、BNIP3蛋白相对表达量均高于假手术组（P<0.05），且稳定HIF-1α组、自噬抑制组高于IRI组（P<0.05），稳定HIF-1α组高于自噬抑制组（P<0.05）。见表2及图2。
3 讨 论
糖尿病可增加心肌对IRI的易感性，影响心肌细胞内信号转导，使心肌对缺血的调节发生障碍[3] 。心肌IRI可导致心肌梗死，且IRI越严重，心肌梗死面积越大。CK-MB是心肌损伤的标志物，心肌IRI时血清CK-MB升高[4] 。LDH水平增高提示心肌炎症性损伤[ 5] 。HIF-1α是对氧敏感的转录因子，在缺氧状态下能调控下游促红细胞生成素、血红素氧合酶-1、诱导型一氧化氮合酶等多种促细胞生存基因的转录激活，发挥心肌保护作用，但在非缺氧环境中易被降解，应用HIF-1α稳定剂可避免其被降解[6] 。刘艳等[7] 报道，HIF-1α稳定表达可抑制线粒体途径介导的心肌细胞凋亡，从而发挥对IRI心肌的保护效应。本研究结果显示，再灌注2h，IRI组、稳定HIF-1α组、自噬抑制组心肌组织HIF-1α蛋白相对表达量、心肌梗死面积、血清CK-MB及LDH水平均高于假手术组，且IRI组、自噬抑制组、稳定HIF-1α组HIF-1α蛋白相对表达量依次增高，心肌梗死面积、血清CK-MB及LDH水平依次降低；假手术组心肌结构正常，IRI组、稳定HIF-1α组、自噬抑制组心肌纤维间质组织肿胀，下突肌松散，大量炎症细胞浸润，且IRI组病变最严重，自噬抑制组次之，稳定HIF-1α组较轻；提示稳定HIF-1α表达可缩小心肌梗死面积，减轻心肌IRI，发挥心肌保护作用，抑制自噬可减弱HIF-1α的心肌保护作用。
自噬被认为是心肌IRI最重要的病理生理机制。文献[8] 报道，自噬通过清除受损的细胞器（破碎的线粒体）、错误折叠的蛋白质、细胞内病原体或回收细胞成分，在细胞体内平衡中发挥重要作用。增强自噬可使细胞损伤最小化，并加速组织恢复，从而保护心肌细胞][9] 。BNIP3是线粒体外膜蛋白，在自噬体-溶酶体融合的调控中起重要作用，是功能性线粒体自噬必需的蛋白[10-11] 。LC3-Ⅱ是细胞自噬的标志物，其表达增高提示自噬增强[12] 。文献[13-14] 报道，HIF-1α可通过激活下游蛋白BNIP3表达，诱导线粒体自噬，促进糖尿病大鼠心肌细胞存活。宋海岩等[15] 报道，敲除缺血缺氧大鼠心肌H9C2 细胞株HIF-1α基因表达，细胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值及心肌细胞活性降低，认为HIF正向调控缺血缺氧的自噬而发挥心肌保护作用。本研究结果显示，再灌注2h，缺血再灌注组、稳定HIF-1α组、自噬抑制组心肌组织LC3-Ⅱ蛋白相对表达量、BNIP3蛋白相对表达量均高于假手术组，且稳定HIF-1α组、自噬抑制组、缺血再灌注组依次降低，提示稳定HIF-1α表达可能通过促进心肌组织LC3-Ⅱ、BNIP3表达，增强自噬，进而发挥心肌保护作用。但本研究为动物实验，确切结论需进一步研究证实。
参考文献略
