动物行为学系列实验protocol(二十一)｜条件性恐惧
介绍
条件性恐惧实验是一种经典的实验范式，用于研究动物（如小鼠）对于特定刺激与不愉快经历的关联学习和记忆。这种实验通常涉及到三个关键元素：条件刺激（CS，条件性刺激）、无条件刺激（US，无条件性刺激或不愉快的经历）、和条件反应（CR，条件性反应或恐惧反应）。
条件刺激（CS）呈现：在实验中，一个中性的刺激（CS），比如声音或光，会与一个不愉快的刺激（US）同时呈现给小鼠。这使得小鼠开始将原本中性的CS与不愉快的经历关联起来。
无条件刺激（US）的引导：无条件刺激通常是一些会引起小鼠不适或害怕的刺激，比如电击或震动。
条件反应（CR）的测定：在经历了CS和US的多次关联后，小鼠开始表现出对CS的条件反应，即在只呈现CS而没有US的情况下，小鼠仍然表现出害怕和恐惧的行为。
消退阶段：当CS不再伴随US呈现时，小鼠的条件反应（CR）逐渐减弱，这个阶段称为消退阶段。在这个过程中，小鼠学会了适应新的环境和条件，不再对CS表现出强烈的恐惧反应。
一、原理解析：
恐惧条件化：这是实验的核心，是指CS与US的重复关联，导致CS具备了引起恐惧反应的能力。这通常通过记录小鼠的行为或生理指标（如皮肤电反应）来测量。
消退阶段：消退并非意味着完全抹去CS和US的关联，而是形成了一个新的记忆，这个记忆竞争性地抑制了CS和US之间的关联。这体现在小鼠逐渐对CS表现出减弱的恐惧反应。
记忆储存：在小鼠大脑中，基底外侧杏仁核（BLA）、前额皮层的前部（PL）、大脑下壳前额皮层（IL）等区域发挥关键作用。这些区域在条件性恐惧学习和熄灭记忆中扮演不同而关键的角色。
海马输入：海马输入在熄灭记忆回忆期间提供有利于表达熄灭记忆的上下文信息，影响小鼠在不同环境下表达条件反应的倾向。
二、实验流程
2.1 恐惧条件化室的预训练
设备放置：将实验装置放置在隔音或安静的房间中，以减少测试期间的外部噪音；动物应在不同的房间饲养。这样可以防止未参与测试的动物听到声音提示或测试动物的叫声。
动物平静：在测试前，动物应保持平静。如果在测试前更改了动物的位置，应允许长时间的适应新环境期（60-90分钟）。
2.2 延迟提示和情境恐惧条件化
第一天 - 条件化会话
适应期：在开始试验前，给予小鼠2分钟的时间在条件化室内适应，以便探索周围环境。
音调提示（CS）：播放持续15至30秒的音调（听觉提示）。若仅进行情境恐惧条件化，则在条件化过程中不播放音调（CS）。
轻微脚底电击（US）：在音调（CS）播放的最后2秒内施加轻微的脚底电击（US），电击与音调同时结束（1-2秒）。
间隔期：电击（US）后，设定60至210秒的间隔，然后进行第二次相同的试验。
移除动物：在最后一次电击（US）后，应在30至60秒内将小鼠移出条件化室，以减轻其压力并避免影响记忆巩固过程。
第二天 - 情境和提示测试
情境条件化测试：尽量模仿训练会话的条件（包括气味、照明、测试时间等）。测试室应与训练时一样进行清洁，不播放音调提示（CS）。
观察动物行为：将小鼠放入室内3至5分钟，观察其是否出现僵直反应。
结束测试：情境测试完成后，立即将小鼠移回原笼。
提示条件化测试准备：在测试间隔约30分钟后进行。若在同一条件化室内进行提示测试，应改变室内的大小、照明强度、背景、地面纹理及气味，并彻底清洁。
提示条件化试验：让小鼠在室内适应3分钟，然后播放与训练阶段相同强度的音调（CS），持续3分钟。音调结束后，再观察1分钟，然后将动物移出。
2.3追踪提示和情境恐惧条件化
追踪条件化训练：与延迟条件化类似，但区别在于脚底电击（US）是在音调（CS）结束后给予（追踪间隔，2-60秒）。
更多试验次数：为使小鼠将条件刺激（CS）与非条件刺激（US）关联起来，追踪条件化需要更多次试验（例如5次）。试验间应使用变化的间隔时间，以减少对新试验的预期。
第二天测试：情境和提示的僵直反应测试方法与延迟条件化相同。
2.4 控制测试
反向条件化：使用反向条件化作为行为控制手段，以验证学习是否真实反映了延迟或追踪条件化。
反向条件化（也称为逆向条件化）是一种在经典条件化实验中使用的控制方法，用于验证学习是否真实反映了条件反射的形成。这种方法与传统的条件化实验在刺激呈现的顺序上有所不同。
在反向条件化中，非条件刺激（US）先于条件刺激（CS）出现。例如，动物首先接受轻微的脚底电击，紧接着播放音调。这种顺序的改变使得动物难以将条件刺激和非条件刺激联系起来，因为条件刺激不再是预测非条件刺激的可靠信号。
反向条件化的操作步骤：
非条件刺激呈现：首先对动物施加非条件刺激（US），如轻微脚底电击。
条件刺激呈现：在非条件刺激之后立即播放条件刺激（CS），如音调。
重复实验：按照特定的时间间隔重复这一配对过程，以确保动物接收足够的反向条件化训练。
观察行为反应：在训练过程中和训练结束后观察动物的行为反应，特别注意是否出现僵直反应。
反向条件化的核心在于，条件刺激（CS）出现在非条件刺激（US）之后，这使得条件刺激失去了预测非条件刺激的能力。通过这种方法，研究人员可以评估动物对于条件刺激和非条件刺激配对的学习程度，从而验证条件化学习的有效性。
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