宠物饲料中粗蛋白、钙、磷等营养指标检测过程的关键控制点
粗蛋白
粗蛋白的测定一般采用GB/T6432-2018《饲料中粗蛋白的测定凯氏定氮法》。
(1)样品的粉碎粒度:要求粉碎后全部通过0.42 mm标准筛。样品粒度会对分析时间和测量效果产生影响，需要根据不同的样品物理性质及蛋白质含量对样品进行粉碎,过筛；
(2)合适的称样量:根据待测样品中粗蛋白含量的高低，预估盐酸标准溶液的使用量,保证滴定体积在10 mL以上，一般鱼粉、肉粉、羽毛粉、玉米蛋白粉类饲料原料称样量为0.25g左右，豆粕、棉粕、浓缩饲料称样量为0.40g左右，配合饲料称样量为0.50g左右,玉米、次粉类样品称样量为0.80 g左右, 一般样品加入6.4 g混合催化剂和12mL硫酸即可，称样量大的样品在消解时可适当补加3~5mL硫酸。研究表明,消化过程中催化剂的性质和用量对最终结果有显著影响；
(3)消解温度和时间一般控制在420°C、4h左右。当消解液为澄清的蓝绿色时,代表消解完全；如消解液为浑浊状，则消解不完全,可能的原因有消解温度偏低、消解时间不够等,需提高消解温度或延长消解时间；
(4)消解过程控制:为防止爆沸导致消化液沾壁、消解不彻底，消解温度应逐渐升高；若样品水分含量较高，直接消解会发生暴沸，可以选择程序升温,180°C维持30 min,270°C维持30 min,420°C维持2~3h；
(5)高脂肪或高糖类样品在消解时应注意防止产生大量泡沫，该类样品称完样后可在消解液中浸泡2h后再进行消解；
(6)蒸馏装置要保持良好的气密性,防止漏气，使用前用硫酸铵(99.9%)进行检查，要求硫酸铵含氮量在21.19%+0.20%；
(7)消化炉的消解孔不能有空位置,可以用空白消化管加硫酸补位；
(8)定期检查各消解孔温度的均匀性,温度偏低的孔会造成消解不完全,结果偏低。可用各孔消解测定同一饲料,结果与平均结果的精密度超出国标要求范围的孔标记不用；
(9)盐酸标准滴定溶液浓度一般控制在0.1mol/L+5%范围内(具体请参照GB/T 601-2016<化学试剂标准滴定溶液的制备》）；在滴定时,盐酸标准滴定溶液浓度过低会消耗过多的滴定液,造成试剂浪费，浓度过高则消耗的滴定液过少，导致较大的系统误差。配制盐酸标准溶液时，需要标定后使用；
(10)混合指示液不可存放时间过长，否则乙醇挥发会导致指示终点颜色发生变化,储存时应注意室温避光、密封保存，有效期为3个月。经验表明,夏季2周、冬季4周内使用效果最佳；
(11)硼酸吸收液尽量现用现配，储存时间不宜过长，全自动程序使用时室温可保存1个月，否则硼酸氨分解挥发，导致结果偏低；
(12)要保证蒸馏过程中的碱性环境,加碱要过量,一般是加入硫酸量的4倍，如在蒸馏过程中加碱后消解液的颜色没有变黑，要立即停止蒸馏,并补加氢氧化钠溶液至消解液变黑；
(13)蒸馏过程中长时间使用高浓度氢氧化钠溶液，管路内部会形成固体结晶,造成管路堵塞从而减少加碱量,甚至无法加碱。因此应定期将氢氧化钠溶液换成温蒸馏水对管路进行清洗；
(14)使用蔗糖代替样品进行空白测定，空白试验应符合标准要求，如果滴定体积过大,应检查试剂质量；
(15)通过有证标准物质或质控样品来验证结果的准确性。
粗脂肪
饲料中粗脂肪的测定一般 采用GB/T 6433-2006《饲料中粗脂肪的测定》。
(1)注意国标的适用范围，先分B类再分A类,油籽和油籽残渣不适用于本标准。膨化膨胀类饲料原料及膨化类饲料产品，使用索氏直接抽提法测定粗脂肪结果严重偏低,应采用酸水解法。乳粉类产品使用索氏直接抽提法测定粗脂肪结果严重偏低，建议采用食品方法进行检测；
(2)石油醚要使用沸点范围40~60°C的，用脱脂棉覆盖样品易有颗粒流出，建议用滤纸包样品。滤纸包的高度要低于提取器虹吸管的高度；
(3)注意回流的速度和时间,调节加热装置，使每小时至少回流10 次，一般样品要求回流60次以上，若回流次数达不到，可适当延长回流时间或提高加热温度；
(4)抽提好的样品放入烘箱干燥前，应先在通风橱内晾一会，挥发除去残留的石油醚；
(5)如使用自动抽提仪或索氏抽提仪，以仪器的使用方法为参考,用质控样验证仪器提取效果，并调节最佳蒸馏速度；
(6)可用无水乙醚代替石油醚进行抽提样品；
(7)抽提过程严禁明火加热，保持室内良好的通风，最好在通风柜中进行。
粗纤维
饲料中粗纤维的测定一般 采用GB/T 6434-2006《饲料中粗纤维的含量测定过滤法》,注意该方法的适用范围，粗纤维低于10g/kg的饲料样品不能用此法进行检测。
(1)样品的粒度对结果的影响较大,一般要全部通过1 mm标准筛,有研究表明,粒度越大，粗纤维含量越高；
(2)控制样品的称样量在1g左右，称样量太大时，酸碱洗涤不完全；
(3)根据样品的脂肪和碳酸盐含量情况选择合适的前处理方式:粗脂肪含量小于10%、碳酸盐含量小于5%的样品，不需要进行预处理。粗脂肪含量大于10%的样品,按规定方法进行预脱脂,否则消耗碱影响结果；碳酸盐含量大于5%的试样，按照规定方法进行除碳酸盐，否则消耗酸影响结果；
(4)氢氧化钾溶液配制时,应使用煮开后冷却的蒸馏水,以除去水中的CO2；
(5)硫酸溶液和氢氧化钾溶液使用量较大，每次配制溶液体积要满足测定样品需要量；
(6)石油醚应选用沸点范围40~60°C；
(7)酸碱消煮时，溶液易发生暴沸，温度不可过高,为防止溶液迅速上冒，应时刻观察溶液沸腾状态，保持微沸；
(8)沸腾期间保持体积不变，可在烧杯外壁溶液高度划线标记，通过补加冷的蒸馏水到标线处，来保持液体酸碱浓度基本恒定；
(9)清洗残渣时要用热的蒸馏水,切记应提前备好，否则会影响实验进度；
(10)干燥前必须将丙酮挥发完全后再放入烘箱；
(11)灰化时注意事项同灰分测定。
粗灰分
饲料中粗灰分的测定一般采用GB/T 6438-2007《饲料中粗灰分的测定》。
(1)应注意马弗炉的温度不能过高或者过低,一般控制在(550+20)°C,超过600°C会引起磷及硫等盐的挥发，从而对检测结果造成影响，并且在实验过程中，仪器的使用温度应是设备的校准温度。同时，对设备的温度进行校准时，要对常用的温度值进行校准；
(2)做样前，坩埚要先进行灼烧干燥,灼烧时间为马弗炉温度达到550°C后计时30min以上,干燥器中冷却至室温后称重；
(3)炭化要完全:炭化时要注意通风橱对炭化过程中样品的吸力，半盖坩埚盖，小火缓慢加热至无黑烟产生；使用电炉炭化时坩埚要放在石棉网上,且电炉功率不能太大,防止燃烧过于剧烈造成损失，整个过程避免产生明火；
(4)灰化要完全:放入样品前马弗炉应预先加热达到550°C,样品灼烧3h后观察是否有未灰化的黑色炭粒,若无，继续灼烧1h,若有，待坩埚冷却后，加水润湿残渣,烘干后继续灼烧,直至灰化完全；
(5)灰化终点判断:以时间加样品的灰化状态结合判断,不可单纯以时间来判定灰化终点，灰化终点应为样品残灰呈现灰白色或浅灰色。要注意特殊样品，如铁含量高的样品残灰呈现褐色，锰、铜含量高的样品,残灰呈现蓝绿色；
(6)灰化后，不可立刻从马弗炉中取出坩埚或放置在常温的台面上，应待温度稍微下降后再取出样品，否则易导致坩埚遇冷开裂；
(7)玉米蛋白粉、大米蛋白粉等样品灰化后容易有黑色碳粒,需要加水烘干后再次灰化；
(8)一般饲料样品先灰化3h,再灰化1h,即可达到恒重，但部分样品(玉米蛋白粉、大米蛋白粉等)按照国标规定的温度和时间灰化不完全，应适当延长灰化时间,使样品中的有机物完全氧化,减少实验误差。有研究表明，马弗炉的预热时间、预热温度和坩埚摆放方式的变化都会导致结果偏差。
钙
饲料中钙的测定一般采用GB/T 6436-2018《饲料中钙的测定》。
国标中有两种测定方法:高锰酸钾法和乙二胺四乙酸二钠络合滴定法，这两个方法均为滴定法。若是植物性饲料原料或其他钙含量较低的样品，可选用GB/T13885-2017《饲料中钙、铜、铁、镁、锰、钾、钠和锌含量的测定原子吸收光谱法》进行检测，该方法检出限为50mg/kg。测定时要根据样品的类别、性质选择合适的前处理方式，湿法消解加入高氯酸后，严禁蒸干，通常也可和总磷测定共用一份处理液。
1、高锰酸钾法注意事项
(1)甲基红指示剂应定期配制，于棕色瓶中可储存2个月左右；
(2)生成草酸钙沉淀时应注意:将试样分解液于电炉上小心煮沸，向烧杯中慢慢滴加热的草酸铵溶液(42g/L),并不断搅拌，如果溶液变为橙色,应补加盐酸溶液(1:3,体积比)使其变为红色,再煮沸数分钟，防止沉淀形成细小颗粒，草酸铵溶液应提前加热；
(3)室温下放置过夜(12 h)或沸水浴加热2 h,使沉淀陈化；
(4)洗涤草酸钙沉淀时,应使用无灰的中速定量滤纸,必须沿滤纸边缘向下洗，使沉淀集中于滤纸中心，以免损失。每次洗涤不得超过漏斗体积的2/3；
(5)高锰酸钾标准溶液滴定时，最初1~2 滴滴入变红,红色褪去速度较慢，不断搅拌使溶液均匀，随后可匀速滴定，边滴边搅拌，当滴入后红色面积越来越大时,即快到滴定终点，最后半滴滴入，摇匀后溶液呈粉红色, 30 s不褪色，即到终点。配制高锰酸钾标准溶液时，需要标定后使用。
2、乙二胺四乙酸二钠络合滴定法注意事项
(1)要注意加入掩蔽剂的顺序，每加一种试剂，均需充分混匀，若是顺序出现差错或未摇匀,建议重做；
(2)淀粉溶液应现用现配；
(3)三乙醇胺本身黏度较大,配成50%(W/IV)的溶液便于使用；乙二胺由于挥发性较强，也可配成50%(V/V)的溶液使用；
(4)加入氢氧化钾溶液调节pH值到强碱性后应立即进行滴定，防止钙沉淀，一般此时的pH值应大于12；
(5)应在黑色背景下进行滴定,因钙黄绿素指示剂不稳定，一般用固体,指示剂加入量过多,会影响滴定终点颜色的判断。
磷
饲料中总磷的测定一般采用GB/T 6437-2018《饲料中总磷的测定分光光度法》。
(1)注意标准适用范围，本标准适用于饲料原料及饲料产品，饲料添加剂要按照其产品标准规定的方法进行相关指标的检测，比如，饲料添加剂磷酸氢钙中总磷含量测定应按照其产品标准GB 22549-2017《饲料添加剂磷酸氢钙》的规定执行；
(2)磷标准贮备液:制备好的磷标准贮备液(50μg/mL)需置于聚乙烯瓶中，4℃可储存1个月；
(3)显色剂:避光保存，放置时间不宜过久，使用前应检查是否有絮状物和沉淀生成，若有则不能继续使用；
(4)干灰化:国标规定“炭化后，在550°C灼烧3 h(或测粗灰分继续进行)”，对于称样量较大的情况，应适当延长灼烧时间，保证彻底灰化，同时需注意检查坩埚是否炸裂；
(5 )湿法消解时注意安全,加入高氯酸后应防止蒸干；
(6)盐酸溶解法适用于载体内不含有机物的微量元素预混合饲料；
(7)分光光度计在使用时，吸光度一般在0.2~0.8之间时误差较小，低含量样品应加大称样量或增大移取体积,高含量样品应适当进行稀释,使样品的吸光度在标准曲线的范围内；
(8)不同类型样品应选择相应的前处理方式,每次测定时都应重新绘制标准曲线。有入检测总磷时不做标准曲线,一直沿用之前的回归方程进行计算结果。
来源：宠物食品联盟
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