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动物行为与电生理专题⑯丨化学遗传学方法结合动物脑电记录

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2024-09-21 18:44

利用匹鲁卡品制备颞叶癫痫（TLE）小鼠模型，在自由活动状态下通过Plexon 64 Omin System信号采集系统采集小鼠电生理信号，结合化学遗传方法研究癫痫海马高低频信号及其在TLE发生发展中的作用。重点分析海马CA3和CA1区HFOs的特征在不同癫痫状态的变化，以及高-低频耦合变化情况。

Fig1 实验流程图

动物选取与分组本研究选用7-9周龄、体重22-28g的C57BL/6雄性小鼠。电极植入前小鼠以每笼4-5只群居饲养在IVC独立送风笼中，电极植入后进行单笼饲养，小鼠可以在送风笼中自由活动，食物水源充足。环境温度设置在22℃-24℃，以12小时-12小时昼夜循环方式进行照明。小鼠饲养一周以适应环境，期间对小鼠进行抓取训练，以减少实验过程中的应激反应。小鼠随机分为癫痫组（Pilocarpine造模，n=6）和化学遗传干预组（Pilocarpine造模+化学遗传干预，简称干预组，n=7）。癫痫组小鼠CA3脑区注射rAAV-CaMKIIa mCherry病毒，干预组小鼠CA3脑区注射rAAV-CaMKIIa-hM4D(Gi)-mCherry病毒转染CA3脑区锥体神经元。

电极植入手术

病毒转染两周后两组小鼠均在CA3和CA1两个脑区植入16通道Tetrode电极。小鼠利用异氟烷鼻息麻醉，设置麻醉浓度3%~4%诱导麻醉，眼睑和后肢反射消失后，将小鼠固定于立体定位仪上。眼部涂抹红霉素眼膏以降低实验过程中小鼠的不良反应。开启麻醉气体回收系统，利用水循环加热系统，维持小鼠体温，实验过程中观察小鼠状态调整麻醉浓度。术前对手术器械进行消毒，脱毛膏脱去小鼠顶部毛发，剪开头部皮肤，暴露颅骨，清理颅骨表面的黏膜和血液。立体定位仪调平小鼠头部，将前囟和人字缝高度差控制在±0.05mm以内为准。以前囟为零点，将颅钻调零再调至目标位置进行打孔，挑除碎骨及硬脑膜。将16通道Tetrode电极植入到CA3和CA1区。医用胶水和牙科水泥将电极固定，另在颅骨两边植入螺钉电极连接地线，牙科水泥包埋电极。完成手术后小鼠放入IVC笼单独饲养，观察其状态，待小鼠恢复一周后，对其进行癫痫造模。

颞叶癫痫小鼠模型制备

小鼠恢复一周后进行癫痫造模，实验采取腹腔注射匹鲁卡品诱发颞叶癫痫，按图2-2所示流程造模。造模前18-20小时小鼠腹腔注射LiCl（127mg/kg），匹鲁卡品注射30分钟前以2mg/kg的剂量腹腔注射东莨菪碱以阻断匹鲁卡品的外周胆碱能效应，腹腔注射匹鲁卡品（280-320mg/kg）诱发小鼠癫痫发作。按照Racine提出的癫痫等级分类法对小鼠癫痫行为进行分级，其中一级到三级发作被认为是局灶性癫痫发作，四级到五级被认为是全身性发作，小鼠癫痫行为达到四级，且脑电表现为典型癫痫样放电则为造模成功。

Fig2 颞叶癫痫造模流程图

化学遗传学方法

采用化学遗传方法调控CA3脑区锥体神经元活性，使用rAAVCaMKIIa-hM4D(Gi)-mCherry病毒进行化学遗传调控，该病毒携带CaMKIIa启动子，能特异性地在锥体细胞上转染hM4D(Gi)，hM4D(Gi)是一种改造的毒蕈碱乙酰胆碱受体，能与CNO特异性结合，抑制神经元活动。mCherry是红色荧光蛋白标签。干预组小鼠CA3区注射rAAV-CaMKIIa-hM4D(Gi)-mCherry病毒，癫痫组小鼠CA3区注射rAAV-CaMKIIa-mCherry病毒，转染三周后对小鼠进行癫痫造模，在注射匹鲁卡品前半小时小鼠腹腔注射氯氮平-N-氧化物（CNO,剂量10mg/kg），CNO经过代谢转化为氯氮平穿过血脑屏障，作用于表达hM4Di的细胞使其发生超极化，抑制细胞的兴奋性。病毒注射的步骤与电极植入时方法一致，打孔完成后用汉密尔顿注射器吸取病毒，缓慢进针到目标位置，停留10分钟，待脑组织回弹，病毒注射速度设定为20nl/min，停止注射后再停针20分钟待病毒扩散再缓慢拔出注射器，以防止病毒液体回流。病毒以多个点位注射，以确保病毒在CA3区的转染较为精确且覆盖较为完整。完成注射后缝合小鼠头皮，碘伏消毒。小鼠放回笼中饲养，恢复2周后进行电极植入。

数据采集与选取数据

采集在铜网包裹的屏蔽箱中完成。数据采集系统为Plexon 64 Omin System多通道信号采集系统。两组小鼠在癫痫造模前先采集半小时基线数据，再进行癫痫造模和数据采集。将小鼠放在屏蔽箱中，让小鼠在屏蔽箱中自由活动，待小鼠适应环境后开始记录。数据采集参数设置：局部场电位采样率为5000Hz，Spike采样率为40000Hz。在信号处理过程中，采用了低通滤波器，其上限为1000Hz，同时使用了50Hz陷波滤波器以消除干扰。

Fig3 癫痫各状态脑电数据展示

根据脑电记录分为三个状态：1）基线，小鼠正常状态半小时，2）注射东莨菪碱和CNO后半小时，3）注射匹鲁卡品后的发作前期及行为大发作时期。发作前期是指出现细微脑电发作前的状态。每只小鼠因个体差异，发作前期时间有所不同。大发作是指癫痫行为达到四级发作，脑电表现为高频高幅的典型癫痫棘波放电的时期，注射匹鲁卡品后数据连续记录90分钟。

记录到的脑电数据分为场电（LFP）和神经元放电（Spikes），首先要将神经元放电做聚类分析。使用offlinesorter软件进行聚类分析，首先对原始数据进行高通滤波，设置检测波形的长度，设置好检测阈值，将过阈值的神经元放电提取出来，形成一个基于时间轴的集合，将这些检测到的神经元放电利用主成分分析（PCA）方法将其进行特征提取，根据波形特征如波峰、波谷、半波宽等把这些神经元放电置于一个三维特征空间中。采用K-Means算法对这个三维空间中的神经元放电进行聚类，将其归为一个或多个神经元放电。对聚类的结果进行人工挑选去除杂波，最后对神经元聚类结果进行检验。

文献引用：

1.Racine R J. Modification of seizure activity by electrical stimulation. II. Motor seizure [J].Electroencephalogr Clin Neurophysiol, 1972, 32(3): 281-294.

2.Forcelli P A. Seizing Control of Neuronal Activity: Chemogenetic Applications in Epilepsy [J].Epilepsy Curr, 2022, 22(5): 303-308.

3.李艾芮. 化学遗传调控CA3锥体神经元对癫痫海马高频信号的影响[D].电子科技大学,2023.

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