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小鼠乳鼠培养方法 Microsoft Word 文档.doc

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2024-10-04 13:24

小鼠乳鼠心肌细胞培养物品：、培养皿 4 个、小烧杯 2 个、离物品：手术器械（眼科剪 2 把、眼科镊 2 把、手术镊 1 把）心管 4 个、200 目筛网、6 孔板、垃圾桶、一次性吸管、加液枪（配各型号枪头）、75%酒精试剂：D-Hanks 液 2 瓶（其中一瓶在操作前 37℃预热）、2.5％胰酶消化液、加有 FBS（浓度为 10％）的 DMEM 培养基、Brdu、1％明胶、0.4％台盼蓝液操作程序：操作程序： 1、将备用物品（手术器械、培养皿、烧杯、离心管、200 目筛网）进行高压灭菌 2、用酒精擦拭层流台，将高压灭菌后的物品放入层流台，紫外线消毒 30 分钟 3、将 1％明胶加入六孔板中（每孔 1ml） 4、用镊子夹住小鼠颈部将小鼠在酒精中浸泡两次，每次 2-3 秒 5、将消毒后的小鼠放入培养皿中，用剪刀将小鼠头部剪去，并将胸部剪开暴露出心脏，用另一个剪刀将小鼠心脏剪下放入装有预冷的 D-Hanks 液的培养皿中，将心脏剪开清洗残留的血液。 6、将心肌组织转移至另一个装有预冷的 D-Hanks 液的培养皿中进一步剪碎心脏后，加入等体积的 2.5％胰酶。 7、将心肌组织转移至离心管中，反复吹打 10min,静置 2min 后，弃上清。 8、再次加入 D-Hanks 液和等体积的 2.5％胰酶，常温下反复吹打 10min，静置 2min 后将上层液转移至 100ml 容器中，加入含 10%FBS 的 M199 培养基或 DMEM 培养基终止消化 9、重复上一步骤至组织完全消化，适当控制消化时间 10、用 200 目筛网过滤得到细胞混悬液，转移至 10ml 离心管。 11、以 300g 室温离心 5min 12、弃去上清后加入 DMEM+Brdu 培养基吹打，转移至 50ml 培养瓶中后放入 37℃ 5% CO2 培养箱进行差速贴壁 1h 13、将六孔板中的明胶吸出 14、计数心肌细胞 15、按六孔板细胞数（4~5×105 个/每孔）加入细胞悬液，并添加 M199+Brdu 培养基或 DMEM+Brdu 培养基至 3ml 16、至置培养箱 37℃ 5% CO2 培养箱培养。 17、24h 后换液，培养基改用不含 5-BdrU 的培养基继续观察培养。