猫三联mRNA疫苗的研究进展
导读：随着经济发展，饲养宠物成为越来越多人选择的消遣方式，2023年我国宠物猫数量为6980万只，同比增长6.8%，猫消费市场规模同比增长6%，宠物猫数量呈逐年上涨趋势。伴随“健康养宠、科学养宠”理念的深入，宠物医疗市场成为仅次于主粮的第二大细分市场，其市场份额占到28.5%，由于我国宠物用药行业起步较晚，目前大型动保企业仍然以经济动物用药为主，宠物医药产值在整个兽药产值中的比例不足20%，宠物免疫率仍处于较低水平。
随着当前mRNA技术的蓬勃发展以及mRNA疫苗在流行性病毒防控中的巨大成功，使得人们看到mRNA技术在宠物和兽医领域的广泛应用前景。本篇文章中，菌菌通过查询猫三联mRNA疫苗的最新发明专利，汇总了猫三联疫苗的研究现状、以及猫三联mRNA疫苗的开发前景。
01
猫三联mRNA疫苗研究现状
1.1猫三联mRNA疫苗组成及病毒特征
猫三联mRNA疫苗是用于由三种猫常见传染病毒猫疱症病毒（FHV）、猫杯状病毒（FCV）及猫细小病毒（FPV）导致的猫鼻气管炎、猫杯状病毒病、猫泛白细胞减少症的预防免疫。
1.1.1 猫疱症病毒（FHV）
FHV属于大型病毒（100-130nm），具有包膜及双股DNA，于细胞核内进行增殖。FHV的gB蛋白和gD蛋白是极为保守的免疫原性蛋白，作为研究疱疹病毒亚单位疫苗常选择的靶蛋白：（1）gB蛋白是由UL27基因编码的949个aa组成的囊膜糖蛋白，是FHV囊膜表面的重要组成部分，对病毒入侵细胞、病毒复制、细胞融合及在细胞间传播起着决定性作用。（2）gD蛋白是病毒囊膜的主要成分，存在于感染的细胞膜上，能与细胞表面的分子特异性结合，诱导机体产生细胞免疫及体液免疫，在病毒传入易感细胞中其重要作用。
1.1.2 猫杯状病毒（FCV）
FCV是一种小的、无包膜的单股RNA病毒，属于杯状病毒科疱疹病毒属，FCV的VP1蛋白是一种具大部分中和抗体表位的结构蛋白，在病毒粒子的形成、抗原决定及病毒-宿主细胞的相互作用中起到关键作用。
1.1.3 猫细小病毒（FPV）
FPV是一种无囊膜的单链DNA病毒（18-26nm），基因组两端含有发夹结构，中间部分编码非结构蛋白（NS1、NS2）和结构蛋白（VP1、VP2），其中VP2蛋白约占所有结构蛋白的90%，是FPV编码的主要抗原蛋白，在免疫应答、识别受体及感染组织过程中发挥重要作用，VP2蛋白上有多个抗原识别位点，能刺激机体中和抗体，起到自我保护作用。
表1 三种常见猫传染病症状及特点
1.2国产猫三联疫苗发展现状
2011年美国硕腾公司旗下的“妙三多”进入中国，作为国内唯一获批的猫三联产品，在国内市场形成长期垄断形势，但由于运输、保存等多种因素导致的国内时常断货现象及其宠物新药注册审批相关政策的逐步开放，相关对国内流行毒株针对性更强的国产猫三联产品上市在即。
2023年8月-2024年1月，涉及瑞普生物、中牧股份、普莱柯在内的共7款“猫三联”疫苗产品通过农业农村部应急评价，获得生产批准，标注着国产猫用疫苗正式实现突破。
表2 国产猫三联疫苗产品目录
01
猫三联mRNA的制备及免疫反应
浙江大学唐建斌教授等申请的发明专利“用于预防猫鼻气管炎、猫杯状病毒病、猫泛白细胞减少症的三联mRNA疫苗及其制备方法”中的猫三联mRNA疫苗由表达猫疱疹病毒 gB蛋白、猫疱疹病毒 gD蛋白、猫杯状病毒 VP1蛋白和猫细小病毒 VP2蛋白的mRNA结合脂质体包裹方案混合后制备，4条序列均进行了密码子优化。其中：
编码猫疱疹病毒gB蛋白的基因为缺失3'端第2440-2847位核苷酸序列；
编码猫疱疹病毒gD蛋白的基因为缺失3'端第988-1125位核苷酸序列；
编码猫杯状病毒VP1蛋白的基因为缺失5'端第4-372位核苷酸序列。
2.1 猫三联mRNA的制备方法
研究人员同时设计了复制型和非复制型的RNA，方法简述如下：
非复制型mRNA合成质粒：按T7启动子序列、5'UTR区、改造的表达抗原蛋白的密码子优化基因序列、3'UTR区和3'末端Poly(A)尾顺序构建于pUC克隆载体，获得非复制型mRNA质粒，包括T7-FHV-gB、T7-FHV-gD、T7-FCV-VP1和T7-FPV-VP2，其中Poly(A)尾末端含Bsa I限制性内切酶位点，后利用牛痘病毒加帽酶将7-甲基鸟苷帽结构添加到线性化mRNA 5'末端。
图1 非复制型猫三联mRNA转录模板质粒图谱
复制型mRNA合成质粒：按T7启动子序列、5'UTR区、VEE复制酶基因nsp1-4区、改造的表达抗原蛋白的密码子优化基因序列、3'UTR区和3'末端Poly(A)尾顺序构建于VEE克隆载体，获得复制型mRNA质粒，包括VEE-FHV-gB、VEE-FHV-gD、VEE-FCV-VP1和VEE-FPV-VP2，其中Poly(A)尾末端存在一个Mlu I限制性内切酶位点，后利用牛痘病毒加帽酶将7-甲基鸟苷帽结构加到线性化mRNA 5'末端。
图2 复制型猫三联mRNA转录模板质粒图谱
LNP-mRNA：a)将SM-102、DSPC、DMG-PEG2000和胆固醇按摩尔比50∶10∶38.5∶1.5，总质量为480μg，溶于100μL无水乙醇中；b)在涡旋的条件下，将该乙醇溶液快速注入300μL含cap-gB-mRNA和cap-gD-mRNA各2μg、cap-VP1-mRNA和cap-VP2-mRNA各3μg(或cap-VEE-gB-mRNA和cap-VEE-gD-mRNA各2μg、cap-VEE-VP1-mRNA和cap-VEE-VP2-mRNA各3μg)的20mM醋酸钠缓冲液中，剧烈搅拌20s后静置10min，制得纳米颗粒；c)将制得的含有纳米颗粒的乙醇醋酸钠混合溶液，在10mM的PBS溶液中透析2～4h除去乙醇，经超滤浓缩后得LNP-gB+gD+VP1+VP2-mRNA或复制型LNP-VEE-gB+gD+VP1+VP2-mRNA
2.2 猫三联mRNA疫苗的免疫效应
研究人员对制备的三联mRNA疫苗LNP-gB+gD+VP1+VP2-mRNA和复制型三联mRNA疫苗LNP-VEE-gB+gD+VP1+VP2-mRNA进行免疫效用评估，将44只6周龄的雌性BALB/c品系小鼠随性等分为11组：阴性对照组(Mock)、非复制型三联mRNA疫苗组、复制型三联mRNA疫苗组、非复制型单价mRNA疫苗组(T7-B组，T7-gD组，T7-VP1组和T7-VP2组)和复制型单价mRNA疫苗组(VEE-gB组，VEE-gD组，VEE-VP1组和VEE-VP2组)；在第0天和第30天肌内注射上述疫苗，第二次免疫后的第7天，经眼眶途径采血，收集采集的血清样品，测定针对三种病毒的特异性抗体水平，结果三联mRNA疫苗能有效激活体液免疫产生特异性抗体，抗体水平优于单价mRNA疫苗，且简化接种程序，达到一次免疫接种可同时预防和控制猫鼻气管炎、猫杯状病毒病、猫泛白细胞减少症的目的。
图3 针对3种病毒的特异性抗体水平
03
总结
此外，更多预防适应症的宠物用mRNA疫苗也处于开发阶段。2024年1月8日，江苏申基同瑞普生物共同签署猫HCPC四联mRNA疫苗合作开发协议，共同研究开发猫鼻气管炎、杯状病毒病、泛白细胞减少症、猫衣原体四联 mRNA疫苗，利用mRNA技术进军宠物疫苗市场。
研究并开发用于预防猫鼻气管炎、猫杯状病毒病、猫泛白细胞减少症等的mRNA联合疫苗，对于猫主要疫病的防控具有积极的意义。相较于传统疫苗，mRNA疫苗具有生产工艺简单、开发速度快、无需细胞培养、成本低等优点；相比于DNA疫苗，mRNA疫苗无需进入细胞核，没有整合至宿主基因组的风险，且半衰期可通过修饰进行调整。mRNA疫苗可提供对适应性和先天免疫力的综合刺激，即原位抗原表达和危险信号传递；可诱导“平衡”免疫反应，包括体液和细胞效应因子以及免疫记忆。
参考文献
[1] 华安证券研究所. 宠物行业研究报告.
[2] 唐建斌, 杨永乐, 黄耀伟. 用于预防猫鼻气管炎、猫杯状病毒病、猫泛白细胞减少症的三联mRNA疫苗及其制备方法[P].
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