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狂犬病病毒实验室检测方法

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2024-10-15 02:01

摘要：狂犬病（Rabies）是一种重要的人兽共患传染病，由狂犬病病毒（Rabies virus，RV）感染温血动物和人后引起，近年来又有感染上升的趋势。一种准确、灵敏、快速的实验室检测诊断方法就显得极为重要。现就酶联免疫吸附试验（ELISA）、荧光抗体方法（FAT）、快速荧光抑制灶技术（RFFIT）、反转录－聚合酶链反应（RT-PCR）、荧光定量RT-PCR，基因芯片技术和恒温扩增技术等狂犬病病毒实验室诊断方法做一综述。

关键词：狂犬病狂犬病病毒检测方法

狂犬病（Rabies）是一种重要的人兽共患传染病，由狂犬病病毒（Rabies virus，RV）感染温血动物和人后引起，以恐水、畏光、吞咽困难、狂躁、急性致死性脑脊髓炎，进行性麻痹和最终死亡为主要临床特征。RV可感染多种温血动物引起死亡，表现为高度嗜神经性。脑组织感染RV后遭到破坏，使得狂犬病感染的病死率几乎100%。

据WHO数据显示狂犬病在全世界150个国家和地区出现过狂犬病病例。尽管狂犬病可以通过疫苗免疫进行预防，全世界每年仍有超过5.5 万人死于该病，主要集中在亚、非、拉等发展中国家[1]。中国狂犬病疫情较严重，居世界第2位[2~3]，近年来，狂犬病疫情呈现回升的趋势[4]。检测狂犬病抗原抗体、分析狂犬病的流行特点，并建立高效、快速、可靠的实验室检测方法可以有效控制此病的流行。下面主要针对RV的形态特征和分子结构及主要的检测技术进行概述。

1、狂犬病病毒形态特征　

RV属于弹状病毒科（Rhabdoviridae）狂犬病病毒属（Lyssavirus）血清/基因1 型，单股负链RNA病毒。电镜下观察病毒粒子直径为70～80nm，长160～240nm，一端钝圆，另一端平凹，整体呈子弹状[5]。病毒有双层脂质外膜，其外面镶嵌有1072-1900个8-10nm长的纤突(spike)，为糖蛋白，每个糖蛋白呈同源三聚体形式，电镜还显示了糖蛋白具有“头”和“茎”结构。病毒双层脂质包膜的内侧主要是膜蛋白，亦称基质蛋白(Matrix，简称M)，是狂犬病毒的最小结构蛋白。病毒的中央核心是一个直径为40nm的核衣壳，核衣壳(Nucleocaps)由病毒核酸(-ssRNA)和紧密包在其外面的蛋白组成，呈紧密的连续性螺旋形式，它充满在由脂蛋白外壳形成的空间内，有30一35个卷曲。每个病毒约有1800个紧密排列的核蛋白。另外两种核衣壳核心的蛋白为大转录酶蛋白或称RNA多聚酶(Polymerase，简称L)和磷蛋白(Phosphoprotein，简称P)。N、P和L三种蛋白总称为核糖核酸蛋白(Ribonueleoprotein，简称RNP)[6]。

2、狂犬病病毒基因组结构

RV基因组为不分节段的单股负链RNA，分子质量约为4.6×106，大小约为12kb，由7个功能区组成，包括3′先导区、5个连续的结构基因和5′非转录区。其中约91％的核苷酸为结构基因，由3′端poly（A）→5’端AACA依次为N、P、M、G、L，其长度分别为1421、991、804或805，1675或2059、2069，和6429 或6384个核苷酸，对应的开放读码框（(Open reading frame ,ORF）大小依次为1353、894、609、1575、6429个核苷酸，分别编码核蛋白（NP）、磷蛋白（PP）、基质蛋白（MP）、糖蛋白（GP）和依赖RNA的RNA多聚酶（LP）。在狂犬病病毒3ˊ端有一段58个核苷酸的先导序列，第59位核苷酸是N基因mRNA5ˊ端的起始位点,第一个开放阅读框架是第71位的ATG起始密码子和第1424位的TAA终止密码子之间延伸,编码病毒的核蛋白,核蛋白基因高度保守又高效表达,可以用于狂犬病毒感染的诊断和调查。各结构基因之间的间隔区核苷酸分别为2、5、5、423nt[7]。其中G－L之间的居间序列为伪基因，在某些类型的病毒中可以转录出第6个mRNA。

3、狂犬病病毒的实验室检测

3.1 病毒形态学观察

电镜观察:病毒颗粒呈圆柱体，底部扁平，另一端钝圆,整个病毒粒子的外型呈子弹状，直径75nm，长130~200nm。表面有1072~1900个突起，排列整齐，于负染标本中表现为六边形蜂房状结构。

3.2 组织病理学检测

狂犬病引起的脑炎主要体现在病毒对神经的广泛侵入, 但只局限于细胞损伤[10狂犬病毒G,N基因的表达]。组织病理学变化为一定程度的脑水肿,不存在其他特异的组织病理学变化。据Jogai S.等[8]报道,Adlochi Negri于1903在狂犬病感染组织内观察到胞浆内嗜酸性包涵体,这些包涵体被命名为Negri小体,因此可通过检测Negri小体来确诊狂犬病。Negri小体大多出现在海马回、大脑皮质锥体细胞和浦肯也氏细胞中,较少出现在丘脑、桥脑、髓质、脊髓和感觉神经节等神经组织中。组织切片及海马回、脑干、小脑新鲜组织涂片经Sllers，苏木精-伊红，Mann或其他物质染色后，可观察到Negri小体的存在。Negri小体是典型的圆形或椭圆形有嗜碱性颗粒的嗜酸性物质[9]。

该方法优缺点：当组织学检查发现有狂犬病特征性病变时,通过检测内基氏小体,能达到简便、快速地确诊。然而从感染病毒的动物标本中检测Negri小体，只有50% ~80%的检出率。因此,镜检Negri小体,虽然快速而且容易操作,但检测方法的敏感度不够。

3.3 生物学检测

3.3.1乳鼠颅内接种分离狂犬病病毒法

此方法最初用于狂犬病的诊断是在1935年[10]。改良后MIT,即小鼠病毒中和试验(MVNT)被广泛用于疫苗接种动物和人的抗体检测[11][12]。依照WHO狂犬病专家委员会推荐[13],荧光抗体实验检测阴性的结果的脑样品必须再次经MIT证实。

狂犬病病毒具有较强的嗜神经性,可采用小鼠颅内接种法分离病毒后,再进行狂犬病特异性抗原的检测。MIT具体操作方法为:采集脑或唾液腺等病料加缓冲盐水研磨成10%乳剂,无菌处理后离心,取上清液脑内接种5~7日龄乳鼠,性别、品种不限，每只0. 03 mL,每份标本接种4~6只。乳鼠在接种后继续由母鼠同窝哺养, 3~4 d后如发现哺乳减少,痉挛,麻痹死亡,即可取脑检查包涵体。如经7 d仍不发病,可杀死其中2只,剖取鼠脑作成悬液,如上传代。如第二代仍不发病,可再传代。连续盲传三代总计观察4周而仍不发病者,作阴性结果报告。也可应用3周龄以内的幼鼠,如上作脑内接种。可疑动物脑组织或唾液腺组织可用于病毒的分离,从流行病学角度考虑,检查唾液腺中的病毒更为重要,但脑组织的病毒检出率更高。在欧、美等发达国家,小鼠接种试验逐渐被细胞培养所取代,但小鼠接种试验仍然是发展中国家用以确诊狂犬病的重要检测方法。

MIT方法优缺点：小鼠接种试验敏感，准确率高，适于不具备组织培养条件的实验室检测、分离狂犬病病毒,但耗时较长,仅凭动物发病症状不足以确定为狂犬病病毒感染,常常需要配合免疫荧光法（见下文）作特异性鉴定。

3.3.2细胞培养分离技术

20世纪70年代中期以来,各实验室相继用地鼠肾传代细胞(BHK-21)、鸡胚细胞、鼠成神经细胞瘤细胞(NAC1300)、鼠神经瘤细胞(MNa)和其他传代或原代细胞系分离狂犬病病毒街毒。CIT技术逐渐取代了MIT，是因为CIT技术费用较低，敏感、易于操作，与MIT相比所需时间大大缩短，即从MIT的30天缩短到RTCIT的4天[14]。有研究表明,MNa和NAC1300细胞分离街毒的敏感性并不低于MIT法[15][16]，如果接种物中含有少量的街毒,颅内接种小鼠,仅有50%的分离率,而用CIT检出达99%,但BHK-21细胞分离街毒的敏感性较MNa和NAC1300细胞低。一般来讲,在细胞培养中,感染狂犬病毒的细胞不出现明显的细胞病变(cytoPathiceffect,cPE),但可在接种3~5天时,通过免疫荧光染色（见下文）来检测狂犬病毒是否存在.当病料样品如唾液、脑脊液中所含病毒量很少时,则需要延长培养时间或进行传代培养[17]。

该方法的优缺点:周期短、敏感、成本低,适合大量样本的检测;但本方法需配合免疫荧光进行特异性诊断,需在具备组织培养条件的实验室中进行;样品严重污染细菌或腐败致使样品中病毒失活,会导致病毒分离失败。

3 .4狂犬病病毒抗原抗体检测

3.4.1 荧光抗体试验

荧光抗体实验(Fluorescent Antibody Test, FAT) 狂犬病病毒感染的细胞内有由狂犬病病毒核衣壳聚集形成的包含体。据Dean DJ.等[18]报道, 荧光抗体试验于1958年开始应用,且在20世纪70年代用作狂犬病诊断的常规方法。目前利用荧光抗体实验对抗原进行检测的方法已经渐渐取代了对包含体的检测，该方法是狂犬病参考实验室诊断最常用、最精确、快速和最可靠的方法[19]。FAT操作方法为:脑或神经组织印片、涂片或冰冻切片,与经过异硫氰酸荧光素标记的狂犬病病毒抗血清或免疫球蛋白相互作用,然后在荧光显微镜下进行检查,狂犬病病毒阳性标本中分布有大量的黄绿色荧光颗粒,呈不同的形状和大小,较大的圆形或椭圆形发出强烈荧光者为Negri小体,沙粒或细小的灰尘荧光粒子及丝状荧光物,则为神经元或树突中含有的狂犬病病毒颗粒,荧光颗粒大小范围为0. 24~27Lm。以多克隆抗体为基础建立的FAT,其敏感性及特异性不及MIT,但是,如果利用单克隆抗体,可以增加本方法的特异性,并能区别狂犬病病毒和其他的狂犬病病毒属成员[20][21]。

荧光抗体试验的优缺点：耗时短,整个荧光抗体试验操作仅需30min,若加上涂片、固定,得出结果仅需1~2 h; 敏感性和特异性好;但是需要荧光显微镜、高质量的荧光标记抗体，以及具有良好素养的技术员。

3.4.2免疫组织化学

上个世纪80年代以来,应用各种类型的免疫组织化学方法,在用福尔马林固定病理标本的切片上进行狂犬病毒病毒抗原检测,用以研究狂犬病毒病毒致病机理以及人和动物狂犬病的诊断研究上[22][23][24][25][26][27]

。它是以狂犬病特异性单克隆抗体和多克隆抗体作为一抗(Primary antibodies),以过氧化酶或亲和素-生物素蛋白标记的种属特异性抗体为二抗(secondary antibodies)。研究结果表明, 该方法的敏感度与FAT相同或更高,高于Negri小体组织学检测方法。其它报道也证明过氧化酶标记的方法能获得更好的检测结果[28]曾经有报道,使用亲和素-生物素复合物(Avidin-biotin complex,ABC))和过氧物酶-抗氧化物酶(Peroxidase-antiperoxidase,PAP)结合操作,这两种方法可迅速增强酶促反应，进一步提高其敏感度。

直接免疫过氧化物酶技术或者ABC和PAP系统的优缺点：可以用福尔马林固定的标本作为检测的材料,并且还有相对简单,对材料的处理容易、风险较小等优点[29]。然而这些方法的操作过程耗时较长，所需的试剂和仪器相对较贵,而且某些试剂有毒或具有致癌性，因而并没有被广泛应用。

3.4.3酶联免疫吸附试验

酶联免疫吸附试验(Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA) 最初应用于免疫后动物和人血清中抗狂犬病毒抗体的效价滴定,后来经改进也应用于狂犬病抗原检测。可通过检测脑组织中的狂犬病病毒核衣壳做出诊断。该方法1986年由Perrin P建立,其敏感性及特异性与FAT有很好的相关性(96%),灵敏度略低于FAT[30]。本方法通过狂犬病病毒特异性多克隆抗体捕获狂犬病病毒核蛋白,结合ELISA捕获系统可以检测血清1型(PV株),血清3型(Mokola)株,和欧洲蝙蝠狂犬病毒血清1型(PV株)。检测狂犬病病毒抗体的ELISA 法主要有利用酶标记的抗抗体，检测与固相抗原结合的待检抗体为主要原理的间接ELISA。该法的关键在于包被抗原的纯度，一般采用纯化的病毒G蛋白作为包被抗原。鲁晓知等[31]应用间接混合夹心ELISA（IMEIA）检测人血清中的抗狂犬病病毒抗体；任雅萍等[32]采用抗体捕捉法对传统间接法进行了改进。Cliquet 等[33]建立了定量间接ELISA法检测狂犬病疫苗免疫动物后的血清抗体，该方法以全病毒包被酶联反应板，以辣根过氧化物酶标记金黄葡萄球菌蛋白A（HRP-SPA）检测抗体。该方法已被OIE 推荐为体外检测抗狂犬病病毒抗体的标准方法，其优点在于病毒无需纯化，检测抗体不受种属限制，适合人群及野外动物免疫情况的调查。为了克服间接ELISA的缺点，Sugiyama 等[34]建立了一种新的c-ELISA，该方法以初步纯化的灭活病毒抗原包被酶联反应板，标记抗N 蛋白单克隆抗体作为竞争示踪。该方法与中和试验（Virus neutralization test，VN）具有较高的一致性，相关系数为0. 90，可以检测不同种属的动物血清。双抗原夹心ELISA 是利用酶标记抗原代替间接法中的酶标记二抗，检测的是包括IgG、IgM 等在内的总抗体，可避免血清中非特异性IgG 的吸附以及类风湿因子的干扰产生假阳性反应，从方法学的原理上解决了间接法的缺陷。Yang 等[35]于2006 年首次建立了双抗原夹心检测法（DAS-ELISA）。近年来出现了新型的间接免疫过氧化物酶病毒中和反应测定法（Indirect immunperoxidase virus neutralization，IPVN），Ogawa 等[36]对方法进行了标准化，特异性及敏感性均较高，与现行的国际标准方法检测水平相当，可替代原有方法。

该法的优缺点：适于对腐败的标本进行抗原检测,并且无需昂贵的荧光显微镜,操作简单、重复性好,适合作现场流行病学调查,也可做狂犬病疫苗或狂犬病病毒的鉴别诊断。但是敏感性有所降低,操作过程中要接触到有毒害和致癌作用的试剂。

3.4.4胶体金免疫层析法

胶体金免疫层析法(Gold-immunochromatography Assay, GICA) 胶体金免疫层析法( GICA)是上世纪90年代新发展起来的用于临床样品检测的方法。它是层析法与免疫胶体金技术相结合并且集免疫反应和色谱层析于一体的一种诊断技术,本方法可以达到对抗原浓缩的作用,灵敏度较高。主要原理为,用胶体金代替酶标记抗狂犬病病毒抗体,吸水纤维上的金-抗狂犬病病毒抗体与样品中狂犬病病毒抗原结合后,沿硝酸纤维素膜迁移,硝酸纤维素膜上用羊抗鼠IgG(对照线)和抗狂犬病病毒单克隆IgG(检测线)划线包被,在包被有抗狂犬病毒单克隆抗体处形成“抗狂犬病病毒抗体-狂犬病病毒-金标抗体”的抗原抗体复合物而出现红色线。2004年,徐葛林等[37]人研制的GICA测试条特异性良好,检测可疑狂犬病犬唾液样品GICA与酶免疫检测(EIA)符合率达88.2%。高明华等[38]采用间接法研制了胶体金检测试纸条用于检测RV抗体；Shiota等[39]用直接法研制了检测人血清中RV抗体的胶体金免疫层析试纸条；范晓娟等[40]采用SPA法制备了检测RV抗体的胶体金试纸条。

该法优缺点：其优点包括特异、快速、便捷、不需专业技术人员操作和贵重仪器设备等，特别适合临床现场检测无需洗涤,大大减少了污染机会;不需要仪器设备,易于操作,适合野外诊断;所需时间短,仅为20分钟;但成本较高。

3.4.5乳胶凝集试验

荧光抗体试验虽是检测狂犬病病毒的标准方法,但对细胞完整性有严格要求,对已遭受破坏的组织或者是不能进行切片的组织，荧光抗体试验并不适合,且在野外情况下,不适用该方法。据Kasempimolpom等[41]报道,乳胶凝集反应能成功的在患病狗的脑和唾液中检测出狂犬病毒抗原。这种方法用从高免马血清中提取的抗狂犬病毒IgG包被乳胶颗粒,来检测患病动物脑和唾液中的病毒。Madhusudana等[42]报道,通过对狗的已知阳性和阴性脑和唾液样品中病毒抗原的检测,比较LAT和FAT的检测结果,前者敏感性高达95.2%,特异性高达98.7%,阳性符合率为97.6%,阴性符合率为97.4%。经改良后这种方法也能用于中和抗体的检测和滴定，该方法是使用狂犬病毒糖蛋白包被乳胶微球来捕获动物和人血清中的抗体,据报道该方法具有很高的特异性(100％)和敏感性(95.4%)[43]。

该法的优缺点：该试验适应性强，特异性强，但是需制备并纯化马的抗狂犬病高免血清,然后包被乳胶,进而检测动物唾液和脑的狂犬病病毒。

4 狂犬病病毒核酸检测

4.1 原位杂交

原位杂交法（(In situ hybridization,ISH）是指用特定标记的已知序列核酸为探针，与组织切片中核酸进行杂交，从而对特定核酸序列进行精确定量定位的技术。分子生物学的发展推动了应用原位杂交检测狂犬病病毒RNA的技术发展。病毒的单链RNA可被DNA探针检测,探针可依据病毒基因组RNA、也可依据编码五个病毒结构蛋白的一个mRNA或多个mRNA来设计。根据特异的基因型设计探针可确定福尔马林固定组织中狂犬病病毒的基因型。Jackson等和warner等[44]建立了检测狂犬病病毒特异性RNA的原位杂交法；Praveena PE等[45]建立了原位多聚酶链式反应(in situ PCR)，根据狂犬病毒N基因的保守区域核昔酸序列,制备了用地高辛(digoxigenin)标记的双链核酸探针,来与神经组织细胞和神经纤维中的病毒核酸杂交,当在神经原内和神经纤维上出现兰色斑点时即为阳性信号。

该方法直接以病毒的RNA作为检测对象，敏感快速，但是病毒的RNA容易被RNA酶降解，实验时需采取适当措施加以防止。

4.2反转录聚合酶链式反应

对于腐烂变质待检样品,不能用组织学检查、荧光抗体试验及原位杂交检测,但可采用RT-PCR技术来诊断。该方法对样品的纯度要求低，可以从脑组织、脑脊液、唾液、皮肤及其他组织中扩增出狂犬病病毒特异性核酸序列。还可通过针对每一个基因型设计特异性引物或对RT-PCR产物限制性长度的片断的多态现象的分析。据David D.等[46]报道,利用RT-PCR,可根据不同基因型设计特异性引物,鉴别狂犬病病毒。引物一般选择在N基因,因为狂犬病病毒中该基因最保守，另外,L基因的某些区域同样很保守,也可用于特异性引物设计的靶基因。由于其他方法的局限性或敏感度较低,RT-PCR尤其适用于狂犬病的活体检验。Whitby JE.等[47]将RT-PCR和PCR-ELISA相结合,可区分经典的狂犬病病毒和欧洲蝙蝠狂犬病病毒。该方法采用生物素标记、与扩增产物互补的2个特异探针与地高辛标记的扩增产物混合杂交,固定在微量板上,然后用抗地高辛结合氧化酶的抗体检测。结果显示,该法比Southern杂交敏感100倍,整个步骤可在10 h内完成,具有快速、敏感和简便等优点。

研究表明,半巢式PCR可在36 h内从有狂犬病临床症状的病人唾液和皮肤中检测出经典狂犬病病毒(genotype 1),而荧光抗体试验在相同的样本和脑脊髓液中不能检测到病毒。Heaton PR等[48]用半巢式PCR检测狂犬病病毒,利用Southern-blot杂交和半巢式PCR成功地筛选了7个狂犬病病毒基因型中的6个,用一般的PCR方法检出率为93%,而用半巢式PCR的检出率达100%。

该方法的优缺点是：敏感、特异、结果可靠,节省时间,在3h内便可以得出结果,适合用于临床确诊。但是,与所有的PCR检测技术一样,该方法的高度敏感性和特异性是建立在严格的质量控制基础之上的, 对环境要求高，易出现假阳性。

4.3实时荧光定量PCR

随着分子生物学技术的不断进展,荧光实时定量PCR技术自1992年由Higuchi第一次提出后,经过不断发展完善,到目前为止已经非常成熟。国内外应用这一技术已经建立了多种检测RV的荧光定量PCR方法。标记方法也由最初单一的染料法,发展到特异性更高的探针法,如TaqMan、Molecular、Beacon、Fret等,其中由于TaqMan探针的广泛使用,实时定量PCR的方法也称为TaqMan法。目前, TaqMan探针已被用于病毒定量[49],其结果具有高特异性与高敏感性。

针对我国狂犬病的流行特点，许运斌等[50]针对RV　N基因保守序列设计并合成了一套简并引物和TaqMan探针，在优化反应条件的基础上，建立了检测RV核酸的一步法荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)检测方法，他们建立的qRT-PCR与套式RT-PCR的符合率为100％。检测29份新鲜和5份腐败的临床犬脑组织样品，qRT-PCR与套式RT-PCR均检测出12份阳性的新鲜样品和5份阳性的腐败样品。高志强等[51]建立了古典狂犬病病毒荧光RT-PCR检测技术，并应用该技术对宠物医院提供的犬唾液样品进行了检测，结果显示荧光RT-PCR试验结果同病毒分离检测结果均为阴性，没有发现阳性样本，但从采集的流浪犬唾液样品中检出了阳性样本。陆专灵等[52]根据GenBank 中的狂犬病病毒M 基因序列，选择保守区域设计引物，通过对SYBR-GreenⅠ实时荧光PCR 反应条件进行优化，建立了用于检测狂犬病病毒的SYBR-GreenⅠ实时荧光PCR 方法。Crepin　P等研究表明，采用常规的RT-PCR方法可从唾液样品或CSF样品中检出狂犬病病毒核酸，而且有时与死后确诊结果符合率达100％[53]。Supaporn W等[54]利用TaqMan实时定量RT-PCR对非神经样本进行狂犬病病毒RNA检测的特异性为100％。Wakeley P R等[55]建立了TaqMan实时荧光RT-PCR用于检测狂犬病病毒，结果其灵敏度高于常规的RT-PCR方法，与套式RT-PCR灵敏度相同。结合TaqMan基因型特异探针的RT-PCR的方法能快速有效鉴别病毒，实时荧光定量RT-PCR检测唾液样品比传统RT-PCR的灵敏度高。

该法是一种敏感、快速、重复性好的高通量检测手段，但是需要昂贵的专业仪器，因此限制了其在基层检测实验室的推广使用。

4.4基因芯片技术

基因芯片技术是在20世纪80年代中期开始出现的，目前已经广泛应用于药物的研究与开发、基因表达谱分析、发现与疾病相关的新基因等诸多方面。其测序原理是杂交测序方法，通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法，在一块基片表面固定了序列已知的八核苷酸的探针。张伟等[56]在探针反相杂交技术的基础上，融合基因芯片的基本原理、核酸分子碱基互补配对的原则和酶联显色技术的基本原理建立了RV低密度基因芯片。检测160份可疑犬的血的结果表明该方法比ELISA和RT-PCR灵敏度高、特异性强。王振全等[57]在靶基因的上游引物5′端标记了生物素Biotin，提高了杂交特异性和灵敏度。诊断基因芯片由于在每份检测样品中都设置阳性和阴性参照，并通过分子杂交进行确认，有效地克服了PCR易被污染的缺点。

该法还引进计算机分析软件进行分析、确诊，大大降低了在结果判断过程中的主观因素，使各个实验室得到的结果具有可比性，而且诊断基因芯片检测样本量越大，成本越低；不仅快速、准确、敏感，而且可以同时进行多种病毒的检测，使其具有高通量、高度平行性和高速性的特点。

4.5恒温扩增技术

核酸扩增技术是生物医学领域病原体确认的常用检测技术。近年新发展起来的核酸等温扩增技术，无论是在实际操作还是仪器要求方面，都比PCR 技术更为简单方便，它摆脱了对精良设备的依赖，在临床和现场快速诊断中显示了其良好的应用前景。在众多等温扩增技术中，环介导等温扩增目前已在一定范围内得到了应用。环介导等温扩增技术（LAMP）是日本学者Notmomi等[58]于2000年首先报道的一种新的核酸扩增技术。LAMP技术采用能特异识别靶序列上6个位点的4条引物及1种具有链置换活性的DNA 聚合酶，在恒温条件（一般为60℃~65℃左右）下，1h内其扩增效率可达到109~1010 个数量级。

已有报道Saitou Y等[59]和Hayman D T等[60]通过使用RT-LAMP法来检测狂犬病病毒。许丹[61]等，针对狂犬病病毒基因Ñ型核蛋白保守区设计4条识别靶序列上6个位点的特异性引物,在链置换聚合酶(Bst酶)作用下,60℃恒温1 h内完成扩增。反应特异性强、灵敏度高。17份临床样本的检测结果显示在狂犬病病毒的检测中,LAMP法和传统PCR法的敏感性一致,阳性检出率均为23.5%。黄元等[62]，针对狂犬病病毒的核衣壳蛋白基因（N基因）和大专录酶蛋白基因（L基因）中的高度保守区段分别设计了一套引物，建立了检测狂犬病病毒的快速一步法反转录-环介导恒温扩增（RT-LAMP）方法。提取总RNA后，加入BstDNA聚合酶及反应成分，于63℃恒温水浴箱中放置60min，80℃5min终止反应，加入荧光染料SYBR GREEN Ι，根据颜色变化肉眼判定结果。结果显示，两套引物对狂犬病病毒RNA进行RT-LAMP检测，均有良好的特异性，灵敏度均比RT-巢式PCR高10倍以上。

区别于传统的PCR方法，属于恒温扩增的LAMP技术不需要昂贵的PCR仪器，具有特异性强、等温灵敏、操作简单、扩增反应时间较短且易于观察结果，利于在基层实验室推广使用等优点，但是其有容易被污染的缺点。因此，如果开发一种拥有可靠、快速、等温灵敏等优点的恒温扩增检测技术，将会有巨大的实际应用前景。

5.总结

从发现狂犬病至今，该病一直被认为是世界上最可怕的人兽共患病之一，在亚、非、拉等发展中国家每年仍有数万人被其夺去宝贵的生命。由于本病可通过暴露后免疫接种来控制,因此对与人暴露相关的动物进行早期病毒检测极为重要。血清学检测方法成本低廉，方便快捷，其中以重组蛋白为诊断抗原的血清学方法是一种发展趋势。以RT-PCR方法为代表的检测病毒核酸的方法，准确方便，但是易出现假阳性且需要昂贵仪器设备。而以LAMP为代表的恒温扩增方法易于推广，不需特殊仪器，具有高的灵敏度、特异性和可靠性，具有广泛的实际应用前景。

参考文献

[1]World Health Organization. The programmme on human rabies surveillance and control. URL: www. who. int/emc/diseases/zoo/rabies.

[2]Coleman PG, Fere EM , Cleave land S. Estimating the public health impact of rabies〔J〕. Emerg Infect Dis , 2004, 1:140-142.

[3] 俞永新．狂犬病和狂犬病疫苗［M］．第2版．北京：中国医药科技出版社，2009．

[4]Song M, Tang Q, Wang D M, et al. Epidemiological Investigations of Human Rabies in China [J].

BMC Infect Dis, 2009, 9: 210.

[5]殷震，刘景华主编．动物病毒学［M］．第2版．北京：科学出版社，1997.

[6] 高明华. 狂犬病毒G，N基因的表达、单克隆抗体制备与胶体金免疫层析检测试纸的研制[D]. 吉林大学, 2007.

[7] 俞永新.狂犬病和狂犬病疫苗[M].北京:中国医药科技出版社,2001:127-144.

[8] Jogai S, R adotra BD, Banerjee AK..Immunohistochemical study of human rabies[J]. Neuropathology, 2000, 20(3):197-203.

[9] Meslin F-X, Kaplan MM,KoProwski H. Laboratory techniques in rabies. 4th edition. Geneva: WHO; 1996.P.476.

[10]Jogai S,Radotra BD. Immunohistochemical study of human rabies. Neuropathology 2000,20:197一203.

[11] Johnson HN .The virus neutralization index test in mice. In: Kaplan MM, Koprowski H, editors. Laboratory techniques in rabies. 4th ed. WHO: Geneva:1973,P.94--7.]

[12] Cliquet F, Aubert M,Sagne1.Development of a fluorescent antibody virus neutralization test(FAVN test) for the quantitation of rabies-neutralising antibody. J lmmunol Methods 1998,2]2:79-7.

[13]WHO Expert Committee on Rabies. VIII Report 1992; Technical Report Series 824, WHO, Geneva.

[14] Webster WA. Virus isolation in neuroblastoma cell culture. In: Meslin F-X, Kaplan MM, Koprowski H, editors. Laboratory techniques in rabies, 4th edition.Geneva7 WHO: 1996.p.9-104.

[15]Barrat J, Barrat MJ, Picard M, et al. Diagnosis of rabies by cell culture[J]. Comparative immunology, microbiology and infectious diseases, 1988, 11:207-214.

[16]Bourhy H, Rollin PE, Vincent J, et al. Comparative field evaluation of the fluorescent-antibody test, virus isolation from tissue-culture and enzyme immune diagnosis for rapid laboratory diagno-sis of rabies[J]. J Clin Microbiol, 1989, 27:519-523.

[17] Webster WA. A tissue-culture infection test in routine rabies diagnosis[J]. Canadian J Vet Res, 1987, 51:367-369.

[18] Dean DJ, Abelseth MK. The fluorescent antibody test[J]. Monogr Ser World Health Organ, 1973, 23(23): 73-84.

[19]Meslin FX, Kaplan MM, Koprowski H. Laboratory technique-sin rabies〔M〕. Fourth edition, WTO, Geneva, 1996, 88-95.

[20]Wiktor TJ, Flamand A, Koprowski H. Use of monoclonal antibodies in diagnosis of rabies virus infection and differentiation of rabies and rabies-related viruses.JVirolMethodsl980,1:33-46.

[21]Rupprecht CE, Dietzsehold B, Wunner WH ,et al.Antigenic relationships of Lyssa viruses. In: Baer GM ,editor. The natural history of rabies. Boca Raton: CRC Press; 1991, 69-100.

[22]Tirawatnpong S, Hemachudha T, Mautsathit S ,et al. Regional distribution of rabies viral antigen in central nervous system of human encephalitic and paralytic rabies. J Neurol Sci1989, 92:91-9.

[23] Jogai S, Radotra B D, Banerjee A K. Immunohistochemical Study of Human Rabies [J]. Neuropathology, 2000, 20(3):197-203.

[24]Iwasaki Y. Spread of the virus within the central nervous system .In:Baer GM,editor.The Natural history of rables.CRC Press7 Boea Raton:1991,P.121-32.

[25]Feiden W ,Feiden U,Gerhard l,et al. Rabies encephalitis: immunohistochemical investigation. Clin Neuropathol 1985, 4:156-64.

[26]Kotwal S,Narayan KG. Direct immunoperoxidase test in the diagnosis of rabies an Alternative to fluorescent antibody test. Int J Zoonoses1985, 12:80-5.

[27]Fekadu M, Greer PW, Chandler FW, et al Use of avidin-biotin peroxidase system to detect Rabies antigen in formalin-fixed Paraffin embedded tissues.JVirolMethods1988, 19:91-6.

[28]Bourgon AR,Charlton KM. The demonstration of rabies antigen in Paraffin-embedded tissues using the Peroxidase-antiperoxidase method: a comparative study. Can J Vet Res 1987, 51:117-20.

[29]Last RD, Jardlne JE,Smit MM,et al.Application of immunoperoxidase techniques to formalin-fixed brain tissue for the diagnosis of rabies in southern Africa. Onderstepoort J Vet Res 1994, 61:183-7.

[30]Perrin P, Sureau P. A collaborative study of an experimental kit for rapid rabies enzyme immunodiagnosis (RREID) [J] .Bulletin of the World Health Organization, 1987, 65:489-493.

[31]鲁晓知，徐葛林，朱家鸿，等. 应用间接混合夹心酶联免疫试验法检测人血清中的RV 抗体［J］. 中国人兽共患病杂志，1996，12（4）：42-44.

[32]任雅萍，李德新，张全福，等. 狂犬病毒抗体ELISA 检测试剂盒的改进研究［J］. 微生物学免疫学进展，2004，32（3）：42-45.

[33] Cliquet F, Mcelhinney LM, Servat A, et al. Development of aqualitative indirect ELISA for the measurement of rabies virus-specific antibodies from vaccinated dogs and cats ［J］. J VirolMethods, 2004, 4（117）: 1-8.

[34] Sugiyama M, Yoshiki R, Tatsuno Y, et al. A new competitive enzyme-linked immunosorbent assay demonstrates adequate immunelevels to rabies virus in compulsorily vaccinated Japanese domestic dogs［J］. Clin Diagn Lab Immunol, 1997, 11（4）: 727-730.］

[35]Yang LM, Zhao LZ, Hu RL, et al. A noval double-antigen sandwich enzyme-linked immunosorbent assay for measurement of antibodies against rabies virus ［J］. Clin Vaccine Immunol, 2006, 13（8）: 966-968.

[36]Ogawa T, Gamoh K, Aoki H, et al. Validation and standardization of virus neutralizing test using indirect immunoperoxidase technique for the quantification of antibodies to rabies virus［J］.Zoonoses Public Health, 2008, 55（6）: 323-327.

[37]徐葛林,胡巧玲,吴杰,等.检测狂犬病毒的胶体金免疫层析法的建立及应用〔J〕.中国人兽共患病杂志, 2004, 20 (3):236-240.

[38]高明华,夏咸柱,薛琳,等.狂犬病毒N基因的原核表达及间接ELISA方法的建立［J］.中国人兽共患病学报, 200, 23(1):31-34．

[39]Shiota S, Mannen K, Matsumoto T, et al. Develop and evaluation of a rapid neutralizing antibody test for rabies[J].Journal of Virological Methods,2009,161(1):58-62.

[40] 范晓娟,李刚,邱文英,等.胶体金免疫层析检测犬、猫抗狂犬病病毒IgG抗体的研究[J]．中国人兽共患病学报,2010,26（8）:753-757.

[41] Kasempimolporn S, Saengseesom W, Lumlertdacha B, et al. Detection of rabies virus antigen in dog saliva using a latex agglutination test. J Clin Microbiol 2000, 38:3098-9.

[42]Madhusudana S N, Saraswati S. Development and evaluation of a latex agglutination test for rabies antibodies .J Clin Virol 2003, 27:129-35.

[43]Webster L T, Dawson J R. Early diagnosis of rabies by mouse inoculation : measurement of host irnrnunity to rabies by mouse protection test .Proc Soc Exp Biol Med 1935,32:570-3.

[44]Jackson A C ,Wunner W H. Detection of rabies virus genomic RNA and mRNA in mouse and human brains by using in situ hybridization[J].J Viro,1991,65(6):2839~2844.

[45] Praveen P E, Jayakumar R, Balachandran C, et al. Detection of rabies virus genes by in-situ polymerase chain reaction[J]. VetRes Commun, 2007, 31(6):775~781.

[46] David D, Yakobson B, Rotenberg D, et al Rabies virus detection by RT PCR in decomposed naturally infected brains [J]. Vet Microbio,l 2002, 87(2): 111-118.

[47] Whitby JE, Heaton PR, Whitby HE, et al Rapid detection of rabies and rabies-related viruses by RT-PCR and enzyme-linked immunosorbent assay [J]. JVirolMethods,1997, 69(1-2): 63-72.

[48] Heaton PR, Johnstone P, McElhinney LM, et a.l Heminested PCR assay fordetection ofsix genotypes of rabies and rabies-related viruses [J]. J Clin Microbio,l 1997, 35(11): 2762-2766.

[49]Oleksiewicz M B, Donaldson A I, Alexandersen S. Development of a novel rea-l time RT-PCR assay for quantitation of foot-and-mouth disease virus in diverse porcine tissues [J]. J Virol Methods, 2001, 92(1): 23-35.

[50]许运斌,邵明富,范金红,等.基因1型狂犬病病毒一步法荧光定量RT-PCR检测方法的建立［J］.中国人兽共患病学报,201127(4): 297- 310.

[51]高志强，张鹤晓，柏亚铎，等．狂犬病病毒快速荧光RT-PCR检测方法研究与应用［J］．中国兽医杂志，2010，46(1)：14－17．

[52] 陆专灵，何晓霞，谢琳娟，等. 狂犬病病毒SYBR-Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立[J].基因组学与应用生物学，2012,31（5）：441-446.

[53]Heaton P R,Johnstone P,MacElhinney L M,et al. Hemi-nested PCR assay for the detection of six genotypes of rabies and rabies-related viruses[J] ,J Clin Microbiol,1997,35:2763-2766.

[54]Supaporn W,Vccra T,Pornpun S ,et al. Detection of rabies viral RNA by TaqMan real-time RT-PCR using non-neural specimens from dogs infected with rabies virus[J],J Virol Meth,2012,184:109-112.

[55]Wakeley P R,Jonhson N , McElhinney L M , et al. Development of a real-time, TaqMan reverse tranion-PCR assay for detection an differentiation of Lyssavirus genotypes1,5,6[J]. J Cllin Microbiol,2005,43:2786-2792.

[56]张伟，吴时友，尹燕博，等．狂犬病病毒低密度基因芯片的建立及其与常规检测方法的比较研究[J]．江苏农业科学，2007（2）：:139－141．

[57]王振全，罗宝正，薄清如，等.基因芯片方法检测６种动物源性人兽共患病病原[J]．中国预防兽医学报，2011，33(10): 804- 807.

[58]Notomi T , Okayama H , Masubuchi H , et al . Loop-mediated isothermal amplication of DNA[J]. Nucleic Acids Res,200 ,28:e63. DOI:10.1093/nar/28.12.e63.

[59]Saitou Y ,Kobayashi Y , Hirano S , et al. A method for simulataneous detection and identification of Brazilian dog-and varnpire bat-related rabies virus by reverse tranion loop-mediated isothermal amplification assay[J]. J Virol Meth , 2010, 168:13-17.

[60]Hayman D T , Johnson N , Horton D L , et al .Evolutionary history of rabies in Ghana[J]. Plos Negl Trop Dis , 2011, 5(4):e1001.

[61]许丹，杨松涛，冯娜，等．狂犬病病毒LAMP检测方法的建立及初步应用[J]．中国预防兽医学报，2010，11(30):1476-1479.

[62]黄元，向华，陈晶，等．狂犬病病毒核酸RT-LAMP检测方法的建立[C]//2010年全国狂犬病防控高层论坛，2010：207-212.