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马尔济斯犬并发白质脑髓炎和多神经炎：与人中枢和周围神经系统联合脱髓鞘相似

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2024-10-24 09:08

投稿作者：李文杰

摘要

一只1岁雄性马尔济斯犬出现轻度共济失调和定向障碍4月余。随时间推移，其临床症状从截瘫进展为非活动性四肢轻瘫、叫声改变和吞咽困难。组织学检查提示同时存在白质脑髓炎和多神经炎。PCR和/或免疫组织化学(IHC)染色已排除登革热、日本脑炎、寨卡病毒、犬瘟热、伪狂犬病、狂犬病、弓形虫病、新孢子虫病、利什曼病和脑炎微孢子虫等感染性病原体。神经组织免疫组化检查可见明显的由浸润性T淋巴细胞和B淋巴细胞混合巨噬细胞的异质性细胞群。因此，该病例诊断为白质脑脊髓炎和多发性神经炎，类似于人中枢和周围神经系统联合脱髓鞘(CCPD)，为一种累及人类中枢神经系统和外周神经系统的的自身免疫性炎性脱髓鞘疾病。

关键词：自体免疫性，犬，中枢和周围神经系统联合脱髓鞘(CCPD)，白质脑髓炎，神经炎

1.概述

通常来说，脱髓鞘病变仅限于中枢神经系统(CNS)或外周神经系统(PNS)，罕见同时累及两个部位。中枢和周围神经系统联合脱髓鞘(CCPD)指一种同时累及人类中枢神经系统和外周神经系统的免疫介导性髓鞘损伤性异质性疾病或综合征。CCPD的标志性病变是炎性脱髓鞘并发中枢神经系统和外周神经系统白质炎症。中枢神经系统和外周神经系统的灰质部分病变较轻。曾有研究指出，中枢神经系统的炎性脱髓鞘病变多灶性且随机分布于大脑、小脑、脑干和脊髓的白质。外周神经系统中的轴突变性和星形胶质细胞增生亦呈多灶性表现，可能累及多种外周神经，如视神经、脊神经根和腓肠神经。CCPD患者的临床表现通常各不相同，但截瘫是发病时最常见的临床症状。此外，CCPD可同时累及中枢神经系统和外周神经系统，或起源于二者之一。曾有研究表明，CCPD可能由感染或疫苗接种诱发。抗中枢神经系统和外周神经系统髓鞘碱性蛋白抗体在CCPD患者中的检出率较高。然而，目前仍对CCPD的潜在机制知之甚少。截至目前，尚无动物并发白质脑髓炎和多神经炎的研究报告。该病例为一只马尔济斯犬，其并发白质脑髓炎和多神经炎，伴明显的自身免疫反应，与人类的CCPD非常相似。

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2.病例

一只1岁大的雄性马尔济斯犬因出现轻度共济失调和定向障碍4月余而就诊。其临床症状逐渐从截瘫发展为非活动性四肢轻瘫。该患犬亦可见声音变化和吞咽困难的表现。经初步评估，该动物转院至国立台湾大学动物医院，不幸在运输途中意外死亡。死亡后进行全面尸检；然而，未见病变表现。

对来自于大脑、小脑、脑干、脊髓、舌、甲状腺、喉、气管、肺、心脏、膈肌、胃肠道、脾脏、肝脏、双侧肾上腺、泌尿生殖道、坐骨神经和骨骼肌的具有代表性的组织样本进行组织学检查。对组织进行常规处理，切片厚度5µm，经苏木精和伊红(HE)或LuxolFastBlue 髓鞘染色液(LFB)染色。通过免疫组织化学(IHC)和聚合酶链式反应(PCR)排查多种感染性病原，包括登革热病毒、日本脑炎病毒、寨卡病毒、犬瘟热(CD)病毒、伪狂犬病(PR)病毒、狂犬病病毒、弓形虫、犬新孢子虫、利什曼原虫和脑炎微孢子虫。大脑、小脑、脑干、脊髓和坐骨神经的组织切片经脱蜡后进行免疫组化。组织于修复液中经121°C高压环境加热15分钟(CDV免疫组化)(Trilogy, Cell Marque, Rocklin, CA, U.S.A.)或用100µg/ml蛋白酶K(Roche, Mannheim, Germany)在0.6mol/L Tris溶液(pH 7.5)/0.1%CaCl2中处理15分钟（狂犬病毒免疫组化）。

随后，在室温下将组织切片在2.5%正常山羊血清中的Tris缓冲盐溶液(TBS)溶液中孵化30分钟，随后与抗CDV抗体 (diluted 1:500; clone DV2-12; Santa Cruz Biotechnology，Dallas, TX, U.S.A.)和抗狂犬病毒抗体(diluted 1:3000; anti-nucleoprotein polyclone rabies antibody, kindly provided by Dr.Satoshi Inoue, National Institute of Infectious Disease, Tokyo, Japan)在室温下处理1小时。随后用3%过氧化氢处理切片后在室温下用过氧化物酶结合的二级抗体处理60分钟。暴露于2%二氨基联苯胺3分钟后，用苏木精对载玻片进行30秒的复染。在自动化系统(BondMax, Leica Microsystems Inc, Bannockburn, IL, U.S.A.)中进行以下免疫组化染色: CD11d (diluted 1:50；clone CA18.3C6；P.F. Moore，University of California, Davis，CA, U.S.A.), CD18 (diluted 1:50; clone CA16.3C10；P.F. Moore，University of California), CD3 (diluted 1:400; clone F7.2.38; Dako, Glostrup, Denmark), CD79a (diluted 1:200; clone HM57; Abgent, San Diego, CA, U.S.A.), 胶质纤维酸性蛋白(GFAP; diluted 1:250; clone GA5; Novocastra Laboratories, Newcastle upon Tyne, U.K.)，以及主要组织相容性复合物II(MHCII; diluted 1:400; clone TAL.1B5; Dako)。该患犬的正常脾脏和大脑的内参样本对上述抗体呈阳性反应，并可见靶细胞染色表现。

使用AllPrep DNA/RNA FFPE试剂盒对经福尔马林固定、石蜡包埋的大脑、小脑和坐骨神经组织提取DNA和RNA (Qiagen，Valencia, CA, U.S.A.)。随后立即使用QuantiTect® 逆转录试剂盒 (Qiagen)进行RNA逆转录。分别使用登革热病毒、日本脑炎病毒、寨卡病毒、犬瘟热病毒、狂犬病病毒、伪狂犬病病病毒、弓形虫、犬疫杆菌、利什曼原虫属和脑炎微孢子虫的引物对进行聚合酶链反应(PCR)和逆转录PCR (RT-PCR)。此外，通过Primer3为提取的DNA/RNA设计3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH; GenBank accession no.AB038240.1 and DQ403060.1)引物对以进行质控。PCR和RT-PCR呈GAPDH基因呈阳性，说明DNA/RNA含量充足。此外，将先前曾检测阳性的临床样本作为阳性对照，所有PCR检测中均包括合成DNA序列。

对中枢神经系统进行组织学评估可见大脑和丘脑中的白质多灶性至融合性脱髓鞘，经LuxolFastBlue髓鞘染色液可见明显的苍白染色区（图1A和1B）。脱髓鞘病变以明显的反应性星形胶质细胞增生为特征，伴单个核炎性细胞浸润神经末梢（图1C和1D）。在小脑、脑干和脊髓中，脱髓鞘不太明显，而血管周围单个核炎性细胞浸润是主要的病理变化（图1E和1F）。所检查的颅神经，包括视神经和三叉神经，未见明显组织学变化。

图1. 大脑显微变化的镜下照片。

A. 方框内为大细胞量区域。H&E，bar=500µm。

B. 大脑白质的染色苍白区域，可见单个核炎性细胞数量增加（*）。注意大脑白质染色正常（箭头）。两条黑色虚线为大脑白质的外部边界。LFB染色，条形=500µm。

C. 图1A中黑色虚线矩形内的放大区域。可见星形胶质细胞增生和炎性浸润扩张至白质。H&E，bar=250µm。

D. 图1C的高倍镜图像。可见少量浸润性单个核炎性细胞混合散在的双子星形胶质细胞（箭头）。H&E，bar=50µm。

E. 腰椎脊髓的低倍镜图像。白质中可见血管周围套袖（箭头）。H&E，bar=500µm。

F. 图1E的高倍镜图像。血管周围套袖提示以单个核炎性细胞为主。H&E，bar=50µm。

对外周神经系统的颈、胸、腰和骶部区域的腹侧和背侧脊神经根进行显微镜评估。可见中等数量的淋巴细胞，浆细胞及少量巨噬细胞（图2A）多灶性包围并浸润神经束。炎症组分在腰椎和骶神经根段更为明显，向头侧的胸椎和颈椎处逐渐消失。坐骨神经以及喉和肾上腺周围的神经束可见单个核炎性细胞浸润，伴随含有轴突碎片的消化室腔表现（图2B），与多神经炎相符。

图2.外周神经系统变化的显微图像。

A. 腰部脊神经根区域的以淋巴细胞为主的炎性浸润。H&E，bar=100µm。

B. 以淋巴细胞为主的单个核炎症细胞坐骨神经伴消化室（插图：箭头）。H&E，bar=100µm。

中枢神经系统脱髓鞘病灶的免疫组化染色可见以细胞质内CD3（T淋巴细胞；图3A）染色阳性的细胞为主，混合少量细胞质内CD79a阳性细胞（B淋巴细胞；图3B）和CD18阳性细胞（巨噬细胞；图3C）。病变区域可见广泛性细胞膜MHCII染色阳性，提示表达抗原呈递受体。尽管所有类型的细胞均可条件性表达MHC II，但染色分布表明组织内巨噬细胞、淋巴细胞、小胶质细胞、星形胶质细胞和内皮细胞中的表达升高（图3D和3E）。使用具有重叠星形胶质细胞突起的GFAP肥大星形胶质细胞进行阳性细胞体和细胞突起染色，可见脱髓鞘病灶中存在明显的反应性星形胶质细胞增生（图3F）。在脊髓根和坐骨神经切片中，可见由CD3阳性细胞和CD79a阳性细胞组成的浸润性炎症表现。除细胞质内CD3和CD79a染色外，亦可见大量MHCII阳性抗原呈递细胞，如巨噬细胞、淋巴细胞、雪旺细胞和内皮细胞（图4和图5）。构成环状甲状腺和股四头肌群的肌纤维萎缩，被纤维结缔组织或脂肪组织替代。

图3.浸润脑白质的炎性细胞的显微图像。(A)CD3阳性细胞、(B)CD79a阳性细胞和(C)CD18阳性细胞。(D) 在脑白质脱髓鞘病灶中发现主要组织相容性复合体II类（MHCII）的弥漫性和强阳性膜染色。注：相邻区域仅可见微弱、散在的阳性膜染色。Bar=500µm。(E) 图3D的高倍镜图像。可见大量的MHCII阳性细胞。Bar=50µm。(F) 胶质纤维酸性蛋白(GFAP)染色提示存在反应性星形胶质细胞增生，其特征是单个星形胶质细胞结构域被星形胶质细胞突起的重叠所破坏（箭头）。Bar=50µm。

图4.脊髓神经浸润炎性细胞的显微图像。(A) CD3阳性细胞和(B)CD79a阳性细胞。大多数细胞呈主要的组织相容性复合体II类(MHCII)阳性(C)。Bar=50µm。

图5.坐骨神经浸润炎性细胞的显微图像。(A) 少量CD3阳性细胞和(B)CD79a阳性细胞。大多数细胞呈主要的组织相容性复合体II类(MHCII)阳性(C)。Bar=50µm。

3.讨论

犬白质脑脊髓炎和多神经炎的鉴别诊断包括：

1）感染性疾病，如登革热病毒、日本脑炎病毒、寨卡病毒、犬瘟热病毒、狂犬病病毒、伪狂犬病毒，T、弓形虫、犬疫霉、利什曼原虫属和脑胞内原虫；

2）非传染性疾病，如肉芽肿性脑膜脑炎(GME)、灵缇脑膜脑病(GhME)、坏死性脑膜脑炎(NME)、坏死性脑炎(NE)和急性多神经炎(AP)；

3）既往有/无病毒感染/疫苗接种的髓鞘蛋白自身免疫反应。该病例IHC染色或PCR均未检测到上述病原体。对于非传染性疾病，GME患犬通常在白质和脑膜中可见弥散性血管中心性病变。犬 NME和GhME通常可引起脑膜、大脑皮层和皮质下白质的损伤。最重要的是，GME、NME和GhME不会引起外周神经系统病变，因此以上鉴别诊断在本病例的可能性较低。此外，NE病变特征性见于白质，但外周神经系统不应被累及。此外，AP为外周神经系统的一种自身免疫性疾病，中枢神经系统结构通常完整（表1）。NE和AP病变分布与本病例情况部分吻合。虽然不能完全排除同时发生NE和AP的可能性，但这种可能性较小，因为NE是一种物种特异性疾病，AP与浣熊咬伤有关（表1）。因此，据推测，本病例可能具有与人类CCPD相似的针对髓鞘抗原的自身免疫反应的相同发病机制。

表1. 犬白质脑脊髓炎和多发性神经根炎的鉴别诊断及本病例的调查结果

根据疾病进展情况，CCPD分为:

1）同时累及CNS和PNS

2）CNS病变先于PNS出现

3）PNS病变先于CNS出现

该病例最初可见轻度共济失调和定向障碍表现，可能与丘脑和脑白质的脱髓鞘病灶和明显的星形胶质细胞增生有关。随后从截瘫逐渐进展为四肢轻瘫并伴随声音改变和吞咽困难，可能与外周神经系统病变有关。因此，该病例怀疑起始于中枢神经系统，继发性累及外周神经系统。本病例的临床和组织学表现与人类CCPD相似，后者通常在发病时表现为截瘫。目前尚不清楚该患病动物出现CCPD样疾病的潜在发病机制，但在人类医学中，抗神经筋膜蛋白（NF）-155和NF-186蛋白抗体水平在CCPD患者体内升高。NF186和NF155分别为中枢神经系统和外周神经系统轴突上表达的结蛋白和旁结蛋白。因此，有学者认为，NF155和NF186特异性自身免疫反应可能与人类CCPD的发展有关。

目前尚无动物并发白质脑脊髓炎和多神经炎的文献报道。对于CCPD样病例，应进一步研究其潜在机制，尤其是感染性病原体/疫苗接种与宿主免疫之间的相互作用，以确定中枢神经系统和外周神经系统脱髓鞘的真正原因。

参考文献略

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