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脑声常谈：啮齿动物孤独症模型及评价

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2024-08-14 23:44

孤独症谱系障碍（autism spectrum disorder，ASD）患者的行为表现具有高度异质性，除了社交互动障碍和重复刻板行为两种核心症状外，还表现出其他精神疾病症状，包括运动、语言、智力、感觉、睡眠等障碍，以及发育迟缓、癫痫、强迫症和注意力缺陷多动行为等。腹侧纹状体主要介导奖励、认知和目标定向，与ASD患者的强迫行为、僵化思维、执行功能和异常社会共存模式有关。

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Fig1 常用的啮齿类动物模型在ASD研究中的应用以及优缺点

行为学评估方法

游泳干预方案

幼鼠产后第8天（PND8）时，对WS、KS组大鼠进行8周游泳训练，每周游泳5天，休息2天。PND8的大鼠对应大约1岁的儿童。根据预实验中8日龄ASD幼鼠的游泳情况，制定游泳干预计划。PND8—10为游泳适应阶段，在485mm×350mm×200mm矩形笼内进行游泳干预，水温提前预热，控制在（32±1）℃。在PND8时，大鼠游泳2min，水没过大鼠腿部，水深约3cm。在PND9，大鼠游泳5min，水没过大鼠肚子，水深约3.5～4cm。在PND10，大鼠游泳10min，水没过大鼠头部，水深约4.5～5cm。PND13后，在直径为150cm的圆形水箱中进行游泳干预，水位保持在50cm。PND13-15期间，大鼠每天分别进行15、20、25min的游泳训练。在PND16-26期间，大鼠每天游泳30min，PND27-60期间，大鼠每天游泳40min。

　抓力测试和转棒实验于大鼠PND61-63的每天8∶00进行，两个行为学实验间隔1h。旷场与自梳理行为学测试于19∶00进行自梳理实验。

自梳理实验

又称捋毛实验 (grooming)：小鼠具有梳理毛发的天性，在梳理行为中，揭示了小鼠复杂的固定梳理动作模式，将其仪式化为一种刻板的展示，随后梳理毛发作为反应重复刻板行为的指标广泛适用于孤独症小鼠模型中。常见的捋毛动作包括前肢梳理、摩擦清洗颜面、身体腹侧、尾部和生殖器清理用于分析大鼠的刻板、重复行为。实验大鼠被放置在一个矩形盒子（40cm×34cm×40cm）内，先适应10min，然后使用红外摄像机记录10min内大鼠在黑暗中的自我梳理行为。自我梳理行为包括大鼠舔舐自己的身体和头发、用前爪擦脸、抓挠躯干等。

旷场实验

旷场实验主要检测大鼠的自由活动与焦虑情绪。大鼠被放入矩形空旷盒子中（90cm×90cm×50cm）并进行适应环境，实验区与外界隔音，光照均匀，环境温度维持在（24.0±0.5）℃。实验时用纸板将大鼠轻轻移入旷场中央并同时进行数据采集，视频录制10min。每只大鼠测试完成后清理粪便、尿液，然后用75%酒精消除气味，待旷场完全干燥后放入下一只大鼠进行实验。整个过程实验者保持安静，并远离测试大鼠。通过视频采集系统采集实验录像，使用软件对大鼠运动轨迹和速度进行分析。

抓力实验

抓力实验主要测试大鼠四肢力量。使用最大抓力测试仪进行实验。前2天为适应阶段，第3天进行正式测试。大鼠四肢抓住抓力测试仪上的金属网后，匀速向后拖拽大鼠尾巴，当大鼠前肢松开时记录最高值即为最大抓力。每只大鼠测试3次，每次间隔30min，记录3次实验的最大值为最大抓力。最大抓力可反应肌肉力量、神经肌肉接头功能。

转棒实验

转棒实验用于评估大鼠的运动协调性。使用转棒测试仪进行实验。前2天为适应阶段，适应阶段转棒转速为4r/min，大鼠在转棒测试仪上进行适应，掉落后，放回转棒继续实验，总适应时长为3min/天。第3天正式测试，测试阶段5min内将转棒转速从4r/min匀速增加至40r/min，大鼠从转棒上掉落，或者抓住转棒后连续旋转两圈而不在转棒上行走即停止实验，记录大鼠掉落的时间。每只大鼠测试3次，每次实验间隔30min，取3次实验的最大值。

三箱社交实验

三箱社交实验(three-chamber social test)：根据小鼠的群居性和社会性以及形成一定社交记忆的原理，开发出自动化的三厢社交实验，可以直接自动化的测量小鼠社交行为，并对实验结果进行标准化和高通量的分析。三厢社交实验的基础是正常小鼠具有社交能力，当面对同类时，会更愿意和同类小鼠接触，而不是单处一室；当出现陌生的同类时，正常小鼠能把它和熟悉的同伴区分开来，更多的和陌生个体接触，表现出社交新颖性。三箱社交行为箱整体为敞口的长方体，中间被两块医用有机挡板均分为 3 个独立小室，每个挡板下方均有一个可控制开关的小门方便小鼠自由进出各室。左右两室的角落各有一个铁质的网格状束缚器，束缚放入其中的小鼠。实验前两天，将待测小鼠放入行为房饲养使小鼠熟悉测试环境，减少小鼠因环境差异而造成的实验误差；实验时，通常在较暗的环境中进行，行为箱内光照可以维持在 40 lux，温度保持在 24℃，实验人员避免出现在小鼠的视线之内，并减少噪音的产生，维持环境音量在 30 dB以下，保持安静；每只小鼠实验结束用 70%酒精去除行为箱内气味和异物，并用卫生纸擦拭干净。

居住者-入侵者实验(resident-intruder test)

同一物种成员之间的社会冲突来产生情感和心理压力，让失败者产生社交挫败，失败者会有生理和行为变化。小鼠天生具有领地意识会攻击外来侵入者，研究人员发现统计实验中居住者的攻击性行为和非攻击性的社交行为可以模拟孤独症患者的暴力倾向和社交缺陷。

筑巢实验

筑巢实验(nesting test)：群居小鼠通过筑巢来保温和防御，其筑巢能力与母性行为、家庭社交行为和繁殖等因素有关，具有社会交流的性质。2006 年Deacon 等在初级巢穴评级基础上(0：没有巢；1：平巢；2：巢盖住小鼠)制定了更加精细的 5 分巢穴评分表，广泛应用于小鼠社交行为检测。

超声波发声检测实验

超声波发声(ultrasonic vocalizations, USVs)：USVs 被小鼠用来传递情绪状态相关信息进行互动和交流，与小鼠社会行为密切相关。目前 3 种类型的 USVs 在实验室小鼠中得到了大量研究：幼崽隔离诱导产生的 USVs、青年小鼠社会交流产生的USVs 和成年小鼠社交互作产生的 USVs。Premoli等归纳描述了小鼠幼崽与母亲分离时发出的USVs 并认为其促进了母亲和子女之间的社会交流；发现 USVs 在青年小鼠中与社会互作和运动水平相关；Egnor 等认为成年小鼠求偶和交配时产生的 USVs 在社会、性行为中具有重要作用。

Y-迷宫自发选择实验

Y-迷宫自主选择实验(Y maze spontaneous selection test)：依据小鼠具有探索新环境的天性，1976年Olten等开发了Y迷宫用于测量大鼠的特殊学习和记忆能力。在 ASD 模型中，小鼠如果认定环境和事物后很难做出改变就被认为具有重复刻板的偏执性行为。Y-迷宫由 3 条等长的支臂(35 cm×5 cm×15 cm)和一个连接区组成，每两条臂之间的夹角均为120°，3条臂交汇处的连接区有可供打开的小门，方便小鼠自由进出。

刻板行为分析(stereotyped behavior analysis test)

刻板行为被认为是孤独症谱系障碍的核心症状之一。具体的刻板行为表征最早是从Kanner描述的11名儿童开始为人所知，而在ASD小鼠模型中也观察到一系列刻板行为检测，包括高水平的转圈、空翻、后肢站立、垂直跳跃、重复的前肢运动、咀嚼垫料或无意义咀嚼、摇头和嗅探同一位置等。

弹珠埋藏实验

弹珠埋藏实验(marble-burying tests)：挖掘和掩埋是小鼠的一种典型行为，实验最初用于评估啮齿类动物的焦虑行为，但更偏向于其为测量重复性或强迫性挖掘行为的测试，并可以定量地检测 ASD 小鼠模型中重复刻板行为。实验前预处理和实验环境与三厢社交实验相同。实验时将新鲜无味的垫料加入到崭新的饲养笼中(30 cm×17 cm×16 cm)，深度为 5 cm，并将垫料压平压实；将标准玻璃弹珠(各种款式和颜色，直径约为2 cm，重量约为 5 g)，按 5 排每排 4 弹珠等距离地轻放在垫料上；打开摄像头，记录 30 min 内小鼠的运动情况。每次实验之间，更换鼠笼和垫料，并用温和的洗涤剂清洗弹珠，蒸馏水彻底冲洗，使用前晾干。

明暗穿梭实验(light/dark transition test)

基于小鼠对明亮照明区域的自然厌恶，以及对新环境的自发探索行为，用于检测小鼠的类焦虑行为。明暗行为箱(27 cm×27 cm×45 cm)由大小相同的明箱和暗箱组成，箱体顶部加盖，内部固定有高清摄像机记录小鼠活动数据，明箱内有亮光照明，两箱之间的隔墙有一个可控制的门洞(7.5 cm×7.5 cm)供小鼠穿梭。

新事物识别实验(novel-object recognition test)

目的是评估大鼠在熟悉环境中识别新物体的能力。从那时起，这项测试就开始流行起来，用于测试啮齿类动物的认知记忆。小鼠先天对新物体有探索倾向并通过对新物体(形状、大小等)的灵活变换可检测小鼠短期记忆和认知能力。

Fig2 A.自梳理行为模式图。B.自梳理时间。C.旷场轨迹图。D.旷场边缘停留时间。E.旷场自由活动总距离。F.最大抓力测试模式图。G.最大抓力测试结果。H.转棒实验模式图。I.转棒实验中掉落潜伏期