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文献解读｜视觉刺激诱发的神经活动揭示了小鼠视觉系统的功能层级 – User's Blog!

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2024-10-29 10:29

本次推文向大家介绍一篇应用大规模电生理学记录技术的经典文献: Survey of spiking in the mouse visual system reveals functional hierarchy，它于2021年1月20日发表在Nature杂志上。美国艾伦脑研究所的贾晓轩（现任清华大学生命科学学院副教授）、Joshua H. Siegle与Shawn R. Olsen为主要作者。

在此前关于视觉系统的研究中，层级(hierarchy)这一概念为许多哺乳动物视觉系统的研究体系提供了思路，并且启发了一些强大的多层计算网络。尤其是在灵长类动物中，视觉层级得到了广泛的验证与研究。而在小鼠这个同样具有重要性的研究对象中，尚未出现高说服力的证据证明它的存在。2019年，同样是艾伦研究所的Julie A.Harris在Nature上发表了一篇文献，他利用表达Cre重组酶的小鼠验证了解剖学意义上的层级结构，但是真实的神经信号是否沿着这个层级传播尚未可知。换句话说，功能层级结构(functional hierarchy)需要得到进一步验证，这也正是今天这篇文献的研究重点。

2020年的Nature Neuroscience上其实还报道了艾伦研究所另外一项关于functional hierarchy的研究。它与这篇文献的区别在于，它利用的是双光子光生理记录手段采集的信号，而这篇文献使用Neuropixles这一电生理记录手段。与前者相比，后者可以实现跨皮层记录并且具备着更高的空间分辨率。实际上，这项工作的一大亮点就在于，它建立了一套非常成熟的小鼠大规模电生理学记录体系，并且贡献了有史以来最大的小鼠视觉皮层电生理学记录的公开数据集。下面将介绍这项工作主要的研究内容，一块是整个记录体系的确立，一块是通过对数据的分析证明小鼠视觉区域functional hierarchy的存在。

A survey of visual evoked spiking（记录体系的确立）

这篇文献采用的记录探针Neuropixels是一种高密度硅电极。本公众号曾经在一些推文里介绍过（在体电生理百科｜核心工具与应用）。在这里，研究人员采用了它的1.0版本，每根探针上能够同时记录垂直分布的384个记录通道。由于每个通道的大小（20μm左右）与单个神经元胞体的大小相近，他们可以获得单细胞分辨率级别的高通量电信号。

（Neuropixels user manual Fig3）

研究者们建立了一套完善的操作流程，包括小鼠的头件固定，视觉脑区的定位，开颅手术，探针植入记录以及探针位置的示踪（下图a所示）。最核心的记录环节中，他们将六根neuropixels探针分别插入清醒、头部固定小鼠的脑内不同区域，实现了对于六个视觉皮层区域(V1，LM，AL，RL，PM，AM)以及两个丘脑区域（LGN，LP）神经电信号的同时记录（下图b示意植入位置，图c示意记录信号）。

（截取自本文献Fig1）

在数据处理中，研究者们同样开发了一套成熟的分析体系”ecephys_spike_sorting”，这套体系在后续的相关研究中也被广泛借鉴。首先探针的信号会通过滤波分为动作电位信号(AP)和局部场电位信号(LFP)，前者会进行更进一步的分析，通过Kilosort2进行spike sorting得到每个神经元的spike信号（spike sorting的原理曾在本公众号这篇推文中介绍过SpikeSoring简介及MountainSort工具的简要剖析）。随后经过一些特定后处理，筛选后整合进nwb数据格式中。这套标准化的流程保证了高质量的spike信号获取以及便利的后续分析与共享。

（本文献Extend Data Fig3）

小鼠在实验中被动接受各种类型的视觉刺激。在这里，研究人员重点关注三类刺激：移动光栅（drifting gratings）、全屏闪烁（full-field flashes）以及局部伽柏斑块（local Gabor patches）（分别为下图d，e，f）。这是三类比较经典的视觉刺激，有助于研究整个 functional hierarchy。在全部记录的神经元中，大约有60%都表现出显著的空间感受野（spatial receptive fields）。与之形成对照的是，海马内的神经元只有1.4%有明显的感受野。这佐证了数据记录的可靠性。

（截取自本文献Fig1）

A functional hierarchy of visual areas（视觉功能层级的证明）

在前文介绍的Julie A. Harris成果中，它们构建了如下的解剖学视觉层级结构。在这项工作中，研究人员假设功能层级与解剖学层级基本一致，从以下三个方面展开了验证。

（截取自本文献的Fig2）

不同视觉区域交叉相关分析结果

交叉相关分析（Cross-Correlation Analysis, CCG分析）是一种统计技术，用于评估两个信号序列之间是否存在时间延迟的相关性。在神经科学研究中，CCG分析尤其重要，因为它可以帮助研究者理解不同脑区神经元活动之间的时序关系和相互作用。在这里，研究者们评估了每只小鼠所有功能连接神经元的CCG尖峰时滞的分布，以及不同小鼠峰偏移的综合中位数（见下图b，c）。可以看到V1活动先于其他脑区，而AM活动最后发生，这与解剖层级相符。

(截取自本文献Extend Data Fig7)

为了进一步评估区域之间先后关系，研究人员定义了一个具有方向性的量化标准，它定义了任何两个区域之间正时滞和负时滞联系的相对数量（见下图e），结果发现它的得分与解剖层级的得分非常相似（见下图f）。这进一步佐证了两者的相似性。

（截取自本文献的Fig2）

四个经典的functional hierarchy度量

研究人员选取了四个经典的指标，通过研究它们在不同层级的变化对于functiona hierarchy进行进一步的论证。它们是：神经元对于刺激的反应延迟，视觉感受野的大小，具有相依赖反应的细胞占全体细胞的比例以及神经响应的时间尺度。

关于神经元对于刺激的反应延迟，由于视觉信号由低层级向高层级传播，因此可以预见，随着层级升高，对应区域的视觉反应延迟也应增加。这里，研究人员通过“全屏闪烁”刺激统计这一参数，发现符合上述规律，并且每个区域的延迟与解剖学的结果相吻合（下图a，b与c）;

感受野是神经生物学的一个重要概念，它反映了通路中某一特定神经元会对哪些区域的视觉刺激产生响应。高层级神经元会整合更多的神经元信号，因此通常会具备更大的感受野。在这项工作中，“局部伽柏斑块”刺激被用作测试感受野的大小。可以看到，随着层级增加，视觉感受野大小也逐渐增加(下图d，e与f)；

“移动光栅”是一类经典的神经元刺激，在屏幕上，一组光栅会沿着特定的方向以特定时空频率与相进行移动。低层级的神经元往往会出现对这类简单刺激出现更强的选择性。此处，研究者们研究了神经元对于不同相的响应程度，发现在低层级中，对于相有选择性响应的神经元比例会更高(下图g，h与i)；不同层级的神经元对于视觉刺激出现响应的时间不同，自然它们响应的衰减也会不同。在这里，研究人员对灰屏时间内神经元的尖峰活动自相关函数拟合指数衰减，估计出神经响应的衰减时间尺度。这个指标随着层级的变化也与解剖学的结果类似(下图j，k与l)，随着层级的升高而增加。

（本文献Fig3）

总之，这四个指标强有力地证明了functional hierarchy的存在以及它与解剖层级的一致性。

与行为的相关性

感觉神经元也会参与一些诸如行为等高级功能，这一点在更高层级神经元会有更明显的体现。因此，研究者们建立了一组行为学实验用来验证。小鼠在跑轮上观看一组播放的自然图片，当图片发生变化时，小鼠可以通过舔水获得奖励（下图a）。从下图d可以看出，小鼠对变化后图片（深色）的响应要明显比变化前（浅色）图片的响应强。此外，每个层级出现第一个spike的时间与它解剖层级的位置相符（下图e）。研究人员还提出了一个系数（change modulation index）用来衡量变化的程度，发现随着层级的升高，该系数水平同样上升（下图f）。

（截取自本文献Fig4）

进一步地，研究者们利用随机森林训练了一个小鼠神经元对改变前和改变后图片响应的分类器(下图g)。（决策树是机器学习领域一种利用多次二分达成分类或回归目的的训练模型。而随机森林可以理解为许多抉择树的集合，既能保留树的预测能力，又能避免过拟合）可以看出，利用不同层级训练的分类器分类的准确性不同，且随着层级的升高，分类越准确(下图h)。这也意味着，更高的视觉层级整合了更多的信息，并且与行为的抉择有更多的参与。

（截取自本文献Fig4）

总结一下，这项研究通过Neuropixels探针对小鼠约十万个神经元的神经元电信号进行记录，提供了宝贵的高质量数据集。通过CCG时滞分析以及四项经典层级指标，它验证了小鼠皮层视觉区域的解剖和功能层级之间的显著对应关系。并且又通过行为学实验，对这一结论进行了更进一步的验证，并揭示了不同视觉层级与行为之间的关联。这项研究不仅为了解小鼠跨层级组织的皮层和丘脑视觉区域的编码和信号传导奠定了基础，也为后来的小鼠视觉电生理研究提供了宝贵的经验和参考。

本文作者：宋佳泰｜清华大学

邮箱：laohusong627@gmail.com