宠物鸟H3N8亚型流感病毒的鉴定及利用反义遗传学技术产生重组病毒
【摘要】： 2001年香港大学从香港入港口及鸟园市场的宠物鸟分离得到20株病毒，命名为A／Songbird／Hong Kong，SBxx／2001。其中大多数流感病毒来自鸟的饮用水。流感病毒分离率为5.6％(18／321)，而新城疫的分离率为0.6％(2／321)。大多数流感病毒来自passerineformes(雀科鸟)，少数来自psittocine species(鹦鹉鸟类)。 本文对H3N8亚型23株宠物鸟流感病毒分离株进行了部分及全基因序列测定，分析和分子演化的研究。首先将试验用的毒株在SPF鸡胚接种增殖，提取RNA，RT-PCR扩增，及应用特异引物进行测序，然后用DNASTAR(4.0 edition)和Tree View(1.6.6)软件进行序列和数据编辑，序列翻译，进化树绘制和分析。 进化树分析表明来自不同国家和地区的H3N8流感病毒的每一个基因都非常相似，都形成一个独立的分支，同源率为95.9-100％。特别要强调的是香港2001年的宠物鸟的毒株之间的同源率更高，达到99.2-100％。除了NA基因外，八个基因中七个基因都属于欧亚亚系。NA基因属于北美亚系不属于欧亚亚系，与A／Mallard／Edmont／220／90(H3N8)[MLEDM90](北美亚系)和A／Duck／Hokkaido／8／80(H3N8)[DKHOK80](欧亚亚系)同源率分别为92.8-94.2％和75.9-76.4％。H A基因与A／Aquatic Bird／Hong Kong／399／99(H3N8)[ABHK99]和A／Equine／Jilin／89(H3N8)[EQJL89]的同源性为最高，分别为93.0-94.1％和92.9-93.6％。与其它H3N8流感病毒不同，A／Parakeet／Netherland／33／01的HA基因在97-99位点上有一个额外潜在的糖基化位点NKT。98位点是受体结合为点，该位点的糖基化NKT可影响抗原的空间构型，干扰抗体与病毒的结合；同时也影响病毒与红细胞识别与结合，进而影响了HI的结果。A／Shama／CA(Indonesia)／99病毒的HA基因在抗原位点B191上的G氨基酸不同于其它病毒191位点上的D氨基酸。 所有的宠物鸟H3N8流感病毒NS基因都属于A亚群，同源率为97.8—99.9％。而“A／Duck/New Jersey／30746-5／00(H3N8)[DKNJ00]则属于“B allele”群；A亚群病毒包括人，猪和部份禽流感病毒，而B亚群中只包含禽流感病毒。A亚群与B亚群之间的同源率只有75％。同一亚群之间的同源率大于90％。只有同一亚群的病毒之间才有可能互相重组。 张云 摘要 中国农业科学院博士学位论文 NP荃因与川Aq华‘cB加山Hong Kong/in603/98扭1 INI)【ABHK981同源率为 9 5.6一9 7.9%.M基因与A江加c留HongKOn创698/79(H5N3)的同源率为 97.00/0 .MZ基因的进化速度大于MI基因。以基因与A江加ck八诬ong Ko明IY439197(H 9N2)的同源性为%.9%。PBZ基因与A佗nvironme助倪ong Kong /437一夕卯似5)同源率为95.5%.PBI基因与九。uck/Anyang/ AvL一l/01似SNI)的同 源率为96.踢. 由核昔酸推理得到的氨基酸序列分析表明NP，淞，PBZ和PBI基因的某些位点 的特异性氨墓酸与宿主类型有关.人和猪的淞基因包含的保守性氨基酸为工11，E14， G16，N20和H57，而禽类为Tll，G14，E16，520和Y57。正如九啊。ng Kong/156/97 病毒一样，宠物鸟流感病毒H3NS含有类似人和禽特异性氨基酸E14和G 16。 所有流感病毒NP基因在450位点的氨基酸都是保守的，北美的流感病毒是450N， 而欧亚亚系的流感病毒为4505，包括宠物鸟H3NS流感病毒。该位点氨基酸与病毒地 域相关性可能是流感病毒长期进化的结果。 PA基因只有一个宿主特异性氨基酸在67位:人的流感病毒是67Gin，而猪和禽 流感病毒为Arg，马流感病毒为67Lys。 PBZ基因有多个宿主特异性氨基酸:人的流感病毒分别为64T，81M，1995， 475M，588V，627K和647T:而猪，马，禽的流感病毒是64M， 81T，199A，475L，588A， 627E和647A。 PBI基因没有宿主特异性氨基酸。这与PBI基因负责RNA链的延伸功能有关，这 一功能的广泛性使得PBI蛋白可以完成其功能而不受约束。 然而，宿主特异性是由多个基因决定的，不能片面强调某一个基因.尤其是队和 NA的作用更不容忽视。同时还要考虑病毒在宿主中的适应性及病毒的进化趋势. 血凝抑制实验分析表明18株来自香港的宠物鸟的毒株抗原性极其相似，没有检 侧到抗原差异。但是来自加拿大和川。伍川加，sLab的毒株刀ShamalCA 伽山毗ia)月9和户JP断ak。吐加db盯land 133/01与来自香港2001年分离株的抗原性反 应模式有所不同，与香港2 0 01年的病毒相比有8个低度降低。除了 A/Par司沈e汀NetherlanLdl33101外，所有宠物鸟H3NS流感病毒都与H3亚型A/ Nanc址m创13/oo人的流感病毒的抗血清反应.需要强调的是大部分的香港2 0 01年 的病毒的抗原性都与扣晒抖汕刃正可89极为相似. 动物的复制实验表明香港宠物鸟流感病毒H3NS可以在鸡和鹤鹑的气管内大t复 制，在感染后的第三天，分别在鸡和鹤鹑的气管内检测到1.8一4.510910/ml和 3.5一5.010910/ml的病毒.第五天检测到的病毒t少于感染后的第三天.相反在鹤转 张云 摘要 中国农业科学院博士学位论文 的肠道内并没有检测到病毒:只有两只试验鸡在感染后的第五天的肠道内检测到少t 病毒(0.于1 .510910/m1)。动物在感染期间没有任何疾病症状，体重增加。在感染后 的第三天和第五天，都可在实验动物的饮水中检测
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2003
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