宠物及其生活环境用抑菌去味微生物制剂及其制备方法和应用与流程

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• 2024-11-16 02:37

本发明涉及微生物制剂技术领域，具体涉及一种宠物及其生活环境用抑菌去味微生物制剂及其制备方法和应用。

背景技术：

收入的增长增加了减压、排遣孤独的消费，养宠物的行为也越来越平民化、大众化。据全球最大的企业增长咨询公司frost&sullivan统计，2018年中国养宠用户达到9978万户，比例攀升至22％。2018年宠物猫数量为6700万只，而宠物狗数量则高达7400万只。2018年中国每万户养宠家庭比例也从2013年的16％增长至22％。除猫狗外，中国宠物主还养有1.1亿只其它动物，其中包括8400万只水族类、900万只鸟类、700万只爬行类、700万只啮齿类动物等。

在物质生活日益得到满足的同时，人们对生活质量越来越重视，都期望能有一个更洁净、健康的家居环境。而宠物与人共用一个生活环境时，对保持洁净、健康的家居环境造成了一定难度。

养宠所带来的主要是异味问题和家居卫生问题。宠物异味来源主要包括口腔、皮肤、耳朵、肛门腺以及排泄物等。例如肠胃问题、口腔炎症等均会使宠物有口臭；皮脂腺分泌物、皮肤感染等会使宠物体表散发出各种各样的异味等。目前，有效改善家居环境的方式主要包括：保持通风，让异味自然消散；采用化学消毒剂/清洁剂，如滴露、84消毒液等，对底板、墙面、宠物用具等进行清洁；采用空气净化产品吸附、遮盖空气中的异味。

保持通风要求所有房间均有通风口，并能形成对流。保持通风的方式受天气影响较大，比如冬天为了保持室内温度，通常需要关闭门窗；我国南方空气潮湿，每年梅雨季节需要关闭门窗减少室外潮湿空气进入室内等。化学消毒剂、空气净化剂通常具有较强的氧化功能或者刺激行，持续使用不利于人宠健康。

除此之外，致病菌也是一个非常困扰养宠家庭的问题，宠物排泄物和口腔中都含有大量微生物，宠物舔舐被毛的同时，使二者的微生物进行交叉传播，然后随着活动轨迹或被毛脱落遍布整个家居环境，当我们体抗力水平有所下降时，就极易被感染发病。

技术实现要素：

鉴于此，有必要针对上述问题提供一种宠物及其生活环境用抑菌去味微生物制剂及其制备方法和应用，以提高家庭生活环境质量。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种宠物及其生活环境用抑菌去味微生物制剂，包括功能菌乳酸菌、酵母菌和涅斯捷连科氏菌(nesterenkonia)；所述乳酸菌：酵母菌：涅斯捷连科氏菌的菌落数之比为(3～5)：(8～11)：(0.5～1.2)。

进一步的，所述微生物制剂还包括基质；所述基质主要包括功能菌剂维持存活的营养物质(比如培养基中的营养物质等)、培养过程中所述功能菌的代谢产物和衍生物等。

进一步的，所述乳酸菌包括耐寒乳酸菌(lactobacillusharbinensis)、鼠李糖乳杆菌(lactobacillusrhamnosus)、类谷糠乳杆菌(lactobacillusparafarraginis)；所述耐寒乳酸菌：鼠李糖乳杆菌：类谷糠乳杆菌的菌落数之比为(16～19):(5～7):(2～5)；

所述酵母菌包括布鲁塞尔德克酵母(dekkerabruxellensis)、酿酒酵母(saccharomvcescerevisiae)、弯曲皮状新丝孢酵母(cutaneotrichosporoncurvatus)、嗜酒假丝酵母(candidaethanolica)；所述布鲁塞尔德克酵母：酿酒酵母：弯曲皮状新丝孢酵母：嗜酒假丝酵母的菌落数之比为(79～83)：(4～6.5)：(3～6)：(0.5～1.2)。

进一步的，所述微生物制剂的总菌落数不低于1×108cfu/ml；优选为1～1.8×108cfu/ml。

本发明的宠物及其生活环境用抑菌去味微生物制剂的制备方法，其步骤包括：

1)、将各功能菌分别活化；

2)、分别扩培获得各功能菌的一级种子；

3)、将步骤2)中得到的各功能菌混合并培养，即得。

进一步的，所述功能菌剂包括乳酸菌、酵母菌和涅斯捷连科氏菌(nesterenkonia)。

进一步的，所述步骤2)中各功能菌的培养方法为：将各功能菌分别按常规操作活化后，并分别于培养基中培养，ph调至6.5，30～37℃培养24～36小时；菌落待用。

进一步的，步骤2)中，所述酵母菌培养基成分为：4～10％质量分数的糖蜜，1～3％质量分数的玉米浆，0.1～0.6％质量分数的蛋白质，1～2％质量分数的氯化钠，其余为水；ph为6.5；

所述乳酸菌斜面培养基的成分为：0.5～1.8％质量分数的蛋白胨、1～5％质量分数的牛肉膏、2～10％质量分数的玉米浆、2.8～4.5％质量分数的蔗糖、0.3～1％质量分数的乙酸钠、0.5～2％质量分数的硫酸镁、1～8％质量分数的氯化钠，其余为水；ph为6.5；

所述涅斯捷连科氏菌的培养基配方为：柠檬酸钠0.3％、kcl0.2％、cacl20.02％、蛋白胨1％、mgso4·7h2o2％、琼脂1.8％、nacl5％；ph9.0。

进一步的，所述步骤3)包括：将步骤2)培养得到的各功能菌分别制成等浓度的菌悬液，再于灭菌处理的液体培养基中混合培养，30～37℃培养，定时送检，至菌落数量不低于1×108cfu/ml即可。

进一步的，所述步骤3)中功能菌悬液按照乳酸菌：酵母菌：涅斯捷连科氏菌为(3～5)：(8～11)：(0.5～1.2)的体积比混合。菌种混合液按5％的接种量接种于液体培养基中。

进一步的，所述步骤3)中混合培养的液体培养基配方为：将蛋白胨10g、牛肉浸粉5g、氯化钠10g、柠檬酸钠3g、kcl2g、cacl20.2g、mgso4·7h2o20g溶于灭菌水中，继续添加灭菌水至1000ml，ph调至4～6，灭菌即可。

本发明的宠物及其生活环境用抑菌去味微生物制剂可直接用于家居环境，尤其是养宠家庭的家居环境。也可应用于办公、商场、学校、医院等公共场所，还可以直接用于宠物和人的体表、衣物等。

本发明有益效果：

本发明的微生物制剂是用微生物的培养原液制得的，将功能活菌、培养基的营养物质、功能菌在生长过程中的代谢产物(如各种糖、消化酶、有机酸、抗菌因子等)及其衍生物等集于一体，各功能菌的代谢活动、代谢产物、衍生物等相互促进或制约，使各成分处于一种稳定的共存状态，保证了产品性能的稳定性。

本发明微生物制剂的菌株的能量来源广、对多种环境耐受，可以相互协同或制约。将具有各种优势的乳酸菌、酵母菌和涅斯捷连科氏菌菌种按照本发明的比例复合，共同形成一个优势群体，可以一定程度上避免自身成分菌之间的竞争性抑制，营造一个可持续的稳定的生存环境。

本发明的微生物制剂中各功能菌联合应用，能代谢降解异味成分。除此之外，各功能菌的代谢产物(如生物酶类等)也具有降解异味成分的作用。众所周知的，活菌产品随着存放时间的推移其活菌数量会越来越少，直至菌落数降低到一定程度便失效，其菌落数量减少的主要原因是能量物质消耗以及代谢产物累积所带来的抑制和毒副作用，本发明的微生物菌剂具有更好地去除臭味分子效果，同时可以保持营养物质的低消耗，可减少代谢产物堆积所带来的危害，如此的良性循环可以使本发明产品性能维持时间更久。

具体实施方式

为了更好的说明本发明技术方案所要解决的问题、采用的技术方案和达到的有益效果，现结合具体实施方式进一步阐述。值得说明的是，本发明技术方案包含但不限于以下实施方式。

本发明实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购等途径获得的常规产品。

本发明的宠物及其生活环境用抑菌去味微生物制剂，包括功能菌乳酸菌、酵母菌和涅斯捷连科氏菌(nesterenkonia)；所述乳酸菌：酵母菌：涅斯捷连科氏菌的菌落数之比为(3～5)：(8～11)：(0.5～1.2)，优选3:10:0.9。

在一些实施例中，所述的微生物制剂还包括基质；所述基质主要包括功能菌剂维持存活的营养物质(比如培养基中的营养物质等)、培养过程中所述功能菌的代谢产物和衍生物，如有机酸、酶类、抗菌肽等。

在一些实施例中，所述乳酸菌包括耐寒乳酸菌(lactobacillusharbinensis)、鼠李糖乳杆菌(lactobacillusrhamnosus)、类谷糠乳杆菌(lactobacillusparafarraginis)；所述耐寒乳酸菌：鼠李糖乳杆菌：类谷糠乳杆菌的菌落数之比为(16～19):(5～7):(2～5)；优选17:6:3。

所述酵母菌包括布鲁塞尔德克酵母(dekkerabruxellensis)、酿酒酵母(saccharomvcescerevisiae)、弯曲皮状新丝孢酵母(cutaneotrichosporoncurvatus)、嗜酒假丝酵母(candidaethanolica)；所述布鲁塞尔德克酵母：酿酒酵母：弯曲皮状新丝孢酵母：嗜酒假丝酵母的菌落数之比为(79～83)：(4～6.5)：(3～6)：(0.5～1.2)；优选80:5:4.2。

在一些实施例中，所述的微生物制剂的总菌落数为1～1.8×108cfu/ml；优选1.3×108cfu/ml。

本发明的宠物及其生活环境用抑菌去味微生物制剂的制备方法，包括步骤：

1)、将各功能菌分别活化；

2)、分别扩培获得各功能菌的一级种子；

3)、将步骤2)中得到的各功能菌混合，培养，即得。

在一些实施例中，所述步骤2)中各功能菌的培养方法为：将各功能菌分别按常规操作活化后，并分别于培养基中培养，ph调至6.5，30～37℃培养24～36小时；菌落待用。

在一些实施例中，步骤2)中培养所述酵母菌的培养基成分为：4～10％质量分数的糖蜜，1～3％质量分数的玉米浆，0.1～0.6％质量分数的蛋白质，1～2％质量分数的氯化钠，其余为水；ph为6.5；

在一些实施例中，步骤2)中培养所述乳酸菌的培养基的成分为：0.5～1.8％质量分数的蛋白胨，1～5％质量分数的牛肉膏、2～10％质量分数的玉米浆，2.8～4.5％质量分数的蔗糖，0.3～1％质量分数的乙酸钠，0.5～2％质量分数的硫酸镁，1～8％质量分数的氯化钠，其余为水；ph为6.5；

在一些实施例中，步骤2)中培养所述涅斯捷连科氏菌的培养基配方为：柠檬酸钠0.3％、kcl0.2％、cacl20.02％、蛋白胨1％、mgso4·7h2o2％、琼脂1.8％；ph9.0。

在一些实施例中，所述步骤3)的具体操作包括：将步骤2)培养得到的各功能菌分别制成等浓度的菌悬液，再于灭菌处理的液体培养基中混合培养，30～37℃培养，定时送检，至菌落数量不低于1×108cfu/ml即可。

在一些实施例中，所述步骤3)中功能菌悬液按照乳酸菌：酵母菌：涅斯捷连科氏菌为(3～5)：(8～11)：(0.5～1.2)的体积比混合。菌种混合液按5％的接种量接种于液体培养基中。

在一些实施例中，所述步骤3)中混合培养的液体培养基配方为：将蛋白胨10g、牛肉浸粉5g、氯化钠10g、柠檬酸钠3g、kcl2g、cacl20.2g、mgso4·7h2o20g溶于灭菌水中，继续添加灭菌水至1000ml，ph调至4～6，灭菌即可。

本发明的宠物及其生活环境用抑菌去味微生物制剂可直接用于家居环境，也可应用于办公、商场、学校、医院等公共场所，还可以直接用于宠物和人的体表、衣物等。

验证试验

试验样品(本发明的微生物制剂)制备：

1)、将各功能菌分别活化(：功能菌包括乳酸菌、酵母菌、涅斯捷连科氏菌；其中乳酸菌由耐寒乳酸菌、鼠李糖乳杆菌、类谷糠乳杆菌按17:6:3的菌落数构成；酵母菌由布鲁塞尔德克酵母、酿酒酵母、弯曲皮状新丝孢酵母、嗜酒假丝酵母按80:5:4.2的菌落数构成。

2)、分别扩培获得各功能菌的一级种子：乳酸菌的培养基的成分为：1％质量分数的蛋白胨，5％质量分数的牛肉膏、8％质量分数的玉米浆，3.5％质量分数的蔗糖，0.3％质量分数的乙酸钠，1％质量分数的硫酸镁，1％质量分数的氯化钠，其余为水；ph为6.5；37℃培养24小时；酵母菌的培养基成分为：6％质量分数的糖蜜，1％质量分数的玉米浆，0.6％质量分数的蛋白质，1％质量分数的氯化钠，其余为水；ph为6.5；37℃培养24小时；涅斯捷连科氏菌的培养基配方为：柠檬酸钠0.3％、kcl0.2％、cacl20.02％、蛋白胨1％、mgso4·7h2o2％、琼脂1.8％；ph9.0，37℃培养24小时。

3)、将步骤2)中得到的各功能菌混合并培养：将步骤2)培养得到的各功能菌分别制成菌悬液，按乳酸菌：酵母菌：涅斯捷连科氏菌为3:10:0.9的菌落数之比混合三种菌悬液；将菌种混合液按5％的接种量接种于液体培养基中，37℃培养，定时送检，至菌落数量不低于1×108cfu/ml即可。

液体培养基配方为：将蛋白胨10g、牛肉浸粉5g、氯化钠10g、柠檬酸钠3g、kcl2g、cacl20.2g、mgso4·7h2o20g溶于灭菌水中，继续添加灭菌水至1000ml，ph调至5，灭菌。

一、安全性评估

1.1急性经口毒性试验

将上述制得的样品送检广东省微生物分析检测中心完成试验。

1.1.1试样处理

称取受试样品5.0g，加入无菌水稀释至20ml。

1.1.2动物来源

由南方医科大学提供的km品种spf级小鼠20只,雌雄各半。体重范围18-22g,实验动物生产许可证号：scxk(粤)2016-0041；质量合格证编号：44002100021034。

1.1.3检测条件

动物饲养环境为室温(20-26)℃,相对湿度为(40-70)％,群笼饲养,10只/笼,实验动物使用许可证号:syxk(粤)2016-0156。

1.1.4饲料来源

由北京华阜康生物科技股份有限公司提供。饲料生产许可证号:scxk(京)2014-0008；质量合格证编号:1103221900010119。

1.1.5实验方法

检测依据：消毒技术规范(2002年版)2.3.1急性经口毒性试验选用剂量：剂量设计为5000mg/kg·bw。

方法简述：根据试验要求,设1个剂量组,每组动物20只,雌雄各半。试验前动物禁食16h，自由饮水。经口灌胃1次,每次灌胃平均量为0.4ml/20g·bw，灌胃后继续禁食2h，其后给予正常饮食。观察14天,每天观察1次,记录小鼠死亡情况。

表1急性经口毒性试验表

1.1.6实验结果

在14d的观察期内,实验动物未见明显中毒体征,无动物死亡。

表2急性经口毒性试验结果

根据上述结果，按照《消毒技术规范》中急性经口毒性分级判定,本发明微生物制剂属实际无毒级别。

1.2急性皮肤刺激性/腐蚀性试验

将上述制得的样品送检广州海关技术中心完成试验。

1.2.1受试样品

本发明申请提供的除异味的微生物制剂(产品名称：宠物清新剂，批号：2021.08.12)。

1.2.2动物和饲养条件

动物来源：由广州市花都区花东信华实验动物养殖场提供的普通级新西兰白色家兔4只，体重范围为2.21-2.48kg，实验动物生产许可证号：scxk(粤)2019-0023，质量合格证编号：44007600006702。

饲养条件：饲料由广东省医学实验动物中心提供。动物引进后在本中心的动物房单笼饲养，检疫合格后使用，实验动物使用许可证号：syxk(粤)2018-0137，动物房温度：18℃-26℃，相对湿度：40％-70％。

1.2.3试验方法

试验前约24h将家兔背部脊柱两侧被毛剪掉,剪毛中不损伤皮肤表面,去毛范围各为3cm×3cm。

取受试物0.5ml涂抹在一侧皮肤上，涂抹面积2.5cm×2.5cm，然后用二层纱布(2.5cm×2.5cm)和一层玻璃纸覆盖,再用无刺激性胶布和绷带加以固定。另一侧皮肤不作处理作为对照。采用封闭试验，敷用时间为4h。试验结束后用纯水清除残留受试物并观察结果，参照《化妆品安全技术规范》(2015年版)皮肤刺激性/腐蚀性试验表1进行皮肤反映评分标准对家兔进行评分,对照区和试验区同样处理。

1.2.4结果评价

于清除受试物后的1、24、48、72h观察涂抹部位皮肤反应，参照《化妆品安全技术规范》(2015年版)皮肤刺激性/腐蚀性试验表1进行皮肤反应评分，以受试动物积分的平均值进行综合评价，根据24、48、72h各观察时点最高积分均值，参照《化妆品安全技术规范》(2015年版)皮肤刺激性/腐蚀性试验表2判定皮肤刺激强度，并观察除刺激性以外的其它症状。

1.2.5试验结果

表3受试物对家兔急性皮肤刺激性试验结果记录

是否有除皮肤刺激性以外的其他症状：无。

根据以上结果，按照《消毒技术规范》中皮肤刺激强度分级判定,本发明的微生物制剂属无刺激性级别。

1.3急性眼刺激性试验

将上述制得的样品送检广州海关技术中心完成试验。

1.3.1材料和方法

受试样品：本发明申请提供的除异味的微生物制剂(产品名称：宠物清新剂，批号：2021.08.12)。

1.3.2动物和饲养环境

普通级新西兰白色家兔3只,体重2.24kg～2.36kg,由广州市花都区花东信华实验动物养殖场提供,实验动物生产许可证号：scxk(粤)2019-0023,质量合格证号：no.44007600006702,饲料由广东省医学实验动物中心提供。动物购进后在动物房单笼饲养,检疫合格后使用,实验动物许可证号：syxk(粤)2018-0137,动物房温度：18℃～26℃,相对湿度：40％～70％。

1.3.3试验方法

(1)在试验开始前的24h对试验用家兔的两只眼睛进行检查(包括使用荧光素钠),检查合格的家兔用于试验。

(2)轻轻拉开家兔一侧眼睛的下眼睑,将受试物0.1ml滴入结膜囊中,使上、下眼睑被动闭合1s,以防受试物丢失。另一侧眼睛不作处理作自身对照。滴入受试物后24h时内不冲洗眼睛。

(3)在滴入受试物的1h、24h、48h和72h对动物眼睛进行检查。在24h观察和记录结束后,对所有动物的眼晴用荧光素钠作进一步检查。在每次检查中均参照《化妆品安全技术规范》(2015年版)急性眼刺激/腐蚀性试验表1眼损害的评分标准记录眼刺激反应的积分,根据24h、48h、72h各观察时点的最高积分和恢复时间评价，参照《化妆品安全技术规范》(2015年版)急性眼刺激/腐蚀性试验表3眼刺激反应分级判定受试物对眼睛的刺激强度。

1.3.4试验结果

表4家兔急性眼刺激实验结果

附：是否有除眼部以外的其他作用：无。

根据以上结果，可得出本发明的除异味的微生物制剂无刺激性。

1.4急性吸入毒性试验

将上述制得的样品送检广州海关技术中心完成试验。

检测标准：参照gb/t21605-2008

实验环境：spf级实验动物房,实验动物使用许可证编号：syxk(粤)2018-0086：室温22±1℃,湿度60±5％。

实验动物和饲料：20只spf级昆明种小鼠,雌雄各半,体重18.0～20.0克。实验动物和饲料购自广东省医学实验动物中心，实验动物生产许可证号：scxk(粤)2018-0002；动物合格证号：no.4400720006608。

样品处理：直接使用上述制得的微生物制剂原液作为受试物。

样品染毒浓度：正式试验采用一次限量法,染毒浓度设为5000mg/m3,20只实验动物(雌雄各半)一次吸入染毒4h。

试验步骤：

1)染毒方式：采用动式染毒法,用hope-med8050染毒装置一次吸入染毒4h；

2)染毒条件：进气流速约为3.6m3/h,染毒柜容积0.3m3,进气累计14.7m3,柜内温度：22±1℃,柜内湿度：55～85％,氧气浓度：20±0.5％；试验用液相对密度为1004mg/ml；染毒期间禁食禁水,结束后正常饮食。

3)观察期限及指标：实验观察14天,记录中毒症状及死亡情况,观察期内存活动物每周称重,观察期结束存活动物称重,处死后进行尸检。计算lc50。

实验结果

14天观察期内未见实验动物明显中毒症状及死亡；实验动物大体解剖未见异常；故雌、雄小鼠一次4h吸入染毒lc50>5000mg/m3。本次急性吸入毒性试验结果见表5。

表5受试物对小鼠急性吸入毒性试验结果

本发明的除异味的微生物制剂的lc504h大于5000mg/m3。

1.5有害菌检测

根据《化妆品安全技术规范》(2015年版)微生物指标检测操作方法对上述制得的本发明的微生物制剂进行有害菌检测，目标有害菌为：耐热大肠菌群、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌。结果均未检出。

根据gb4789.4-2016和gb4789.6-2016的规定，对本发明的微生物制剂进行有害菌检测，目标有害菌为：沙门氏菌、大肠埃希氏菌。结果均未检出。

二、功能性验证

1、硫化氢去除率

参照gb/t11742-89、qb/t2761-2006的规定，分别设置两组试验：第一组为空白试验舱1(空白舱1)和样品试验舱1(样品舱1)；第二组为空白试验舱2(空白舱2)和样品试验舱2(样品舱2)。所有试验舱容积均为1.5m3。

试验方法：每组的空白试验舱和样品试验舱通入相同起始浓度的硫化氢气体，再按标准规定对各样品实验舱加入上述制得的本发明的微生物制剂样品，空白实验舱不添加任何样品。静置反应24小时后，测得各舱硫化氢气体浓度如表6所示。

表6硫化氢去除率的实验数据记录

本试验委托广东省微生物检测中心完成。

2、氨去除率

参照gb/t11742-89、qb/t2761-2006的规定，分别设置两组试验：第一组为空白试验舱1(空白舱1)和样品试验舱1(样品舱1)；第二组为空白试验舱2(空白舱2)和样品试验舱2(样品舱2)。所有试验舱容积均为1.5m3。

试验方法：每组的空白试验舱和样品试验舱通入相同起始浓度的氨气，再按标准规定对各样品实验舱加入上述制得的本发明的微生物制剂样品，空白实验舱不添加任何样品。静置反应24小时后，测得各舱氨气浓度如表7所示。

表7氨气去除率的实验数据记录

本试验委托广东省微生物检测中心完成。

3、大肠埃希氏菌抑菌实验

参照qb/t2738-2012(7.3)的规定，进行对大肠埃希氏菌的抑菌实验，结果见表8。

表8大肠埃希氏菌的抑菌实验记录

通过以上实验可见，本发明的微生物制剂对大肠埃希氏菌具有高于99％的抑制效果。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

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