客户文章|不同生态位龟的单细胞图谱研究
龟类动物在我们的生活中随处可见，作为野生动物出没于山川田野、作为观赏动物出现在动物园、作为宠物陪伴于人们身边、作为货物出现在市场等。龟能适应海洋、陆地、淡水生态系统，其广泛的分布与其强大的免疫能力有关，然而关于龟的免疫还有许多未解之谜，所以基迪奥客户使用scRNA-seq技术对来自不同生境的龟外周免疫细胞进行鉴定与比较，发现了许多传统技术无法鉴定的细胞。研究成果为解密龟强大的适应能力提供了新的视角。
发表时间：2022年12月
发表期刊：cells
影响因子：7.666
合作单位：海南师范大学
研究背景
龟广泛分布于多种生态系统，包括海洋、陆地以及淡水生境，其化石记录可以追溯到2亿多年前，是进化独立、形态独特的脊椎动物。在全球范围内有356种龟类动物，但是目前至少一半的物种濒临灭绝。然而，人们对龟在不同生态位的免疫适应性仍然知之甚少。
外周免疫细胞参与了龟的免疫反应。使用传统技术（如：组织化学染色技术、显微镜观察和亚显微技术）在大多数龟中鉴定出五种外周免疫细胞，即嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、异嗜性白细胞和单核细胞。虽然已经使用了多种方法，然而传统方法无法准确对细胞进行分类，而且对龟免疫细胞的分类缺乏共识，阻碍了对其详细免疫功能的了解。scRNA-seq技术的快速发展为细胞分类、发育分析提供了强大的工具和前所未有的机会。
研究目的
研究旨在调查、比较四种不同生态位的龟外周免疫细胞的组成、功能和分化轨迹。
研究方法及思路
样品采集：
3只绿海龟（ Chelonia mydas ）、6只巴西红耳龟（ Trachemys a elegans ）、3只红腿象龟（ Chelonoidis carbonaria ）、6只中华鳖（ Pelodiscus sinensis ），取外周血样本。
scRNA-seq分析思路：
研究结果与分析
细胞图谱构建
为了揭示参与先天性免疫和适应性免疫的主要细胞群体，作者构建了四种龟的细胞图谱，共鉴定了11个细胞类型,包括：单核细胞、中性粒细胞、T细胞、嗜碱性粒细胞、ACKR4细胞、LY6G6C细胞、SPC24细胞、Serotriflin细胞、Ficolin细胞、NKT细胞、B细胞。值得一提的是，研究首次在龟的外周血中发现了ACKR4细胞、Serotriflin细胞、Ficolin细胞、LY6G6C细胞、SPC24细胞和NKT细胞。
然而，这些免疫细胞在不同种龟体内也存在分布差异，其中绿海龟免疫细胞种类最少（5种），而巴西红耳龟免疫细胞种类最多（11种），红腿象龟和中华鳖免疫细胞种类居中（分别有8种和6种，图2）。巴西红耳龟的外周免疫细胞是最多样化的，这可能是巴西红耳龟作为入侵物种，对环境具有极强适应性的原因之一。
图1 marker基因鉴定部分结果
图2 四种龟的外周血免疫细胞分布UMAP图
不同种龟之间免疫组成差异
在同一物种中，通过将特定簇中每个基因的表达量与其余细胞的表达量进行比较，分别从绿海龟、巴西红耳龟、红腿象龟和中华鳖的外周免疫细胞中得到了7222、6888、7222和4599个DEGs。为了了解差异表达基因的功能，作者对差异表达基因进行了KEGG富集分析，并比较不同物种之间免疫细胞的功能差异。
先天性免疫相关细胞
与人类不同， CD14 和 CD16 在龟的单核细胞中不表达，取而代之的是发现六个标记基因 LGALS1、LY86、PLBD1、MYOF、BPI 和 CSF1R 与刺激的正向调节、白细胞趋化和迁移相关。值得一提的是研究首次观察到 MYOF 在单核细胞中表达； MYOF 主要参与对温度刺激的反应和合胞体形成的生物过程，这将单核细胞与相关生物过程关联在一起。
粒细胞是龟天然免疫系统的主要组成部分。通过scRNA-seq技术在龟中鉴定了中性粒细胞与嗜碱性粒细胞，但没有发现嗜酸性粒细胞。其中，研究首次在巴西红耳龟的外周血中发现嗜碱性粒细胞，进一步发现其拥有两种嗜碱性粒细胞亚型并且不同程度地参与了Th1、Th2和Th17免疫。又因为研究中发现嗜碱性粒细胞调节B细胞受体信号通路，作者认为嗜碱性粒细胞和B细胞与T细胞之间的相互作用可能与龟先天性免疫和适应性免疫有关。
适应性免疫相关细胞
研究在巴西红耳龟和红腿象龟的外周血中发现了三个类淋巴细胞群（ACKR4细胞、LY6G6C细胞和SPC24细胞），因此，作者将ACKR4细胞、LY6G6C细胞、SPC24细胞与B细胞、T细胞一起划分为适应性免疫细胞。此外，研究首次报道了B细胞中的 LAMP3 标记基因，并发现不同种间B细胞的分类和功能无明显差异。但与B细胞相比，外周血T细胞的分类在四个物种之间有很大的差异。在红腿象龟外周血中没有发现T细胞，巴西红耳龟外周血有两个T细胞亚群，而绿海龟和中华鳖外周血只有一个T细胞亚群。与哺乳动物外周血细胞的T细胞亚型（CD4 T细胞和CD8 T细胞）不同，巴西红耳龟外周血中的T细胞为CD4 T细胞和CD7 T细胞。
龟的免疫细胞分化谱系
通过对scRNA-seq数据进行拟时分析，研究了外周免疫细胞的发育轨迹。绿海龟的外周免疫细胞有两个谱系（中性粒细胞和单核/淋巴谱系），而巴西红耳龟、红腿象龟和中华鳖的外周免疫细胞有三个谱系（淋巴样细胞谱系、单核/淋巴谱系和中性粒细胞谱系）。
研究表明，在龟中单核细胞、T细胞和B细胞分化为单核/淋巴谱系；中性粒细胞、Serotriflin细胞、NKT细胞和Ficolin细胞分化为中性粒细胞谱系，参与先天性免疫；ACKR4细胞、LY6G6C细胞和SPC24细胞分化为淋巴细胞样谱系，参与适应性免疫。与人类不同的是，龟的中性粒细胞、单核细胞具有不同的分化轨迹，而单核细胞、T细胞、B细胞具有相同的分化轨迹。
图3 龟外周免疫细胞分化轨迹
小结
作者使用scRNA-seq技术绘制了不同生境下龟的外周血免疫细胞图谱，包括生活在海洋环境的绿海龟、生活在淡水及微咸水的巴西红耳龟、生活在陆地的红腿象龟以及生活在淡水环境的中华鳖。通过细胞分群分析首次在龟的外周血中发现ACKR4细胞、Serotriflin细胞、Ficolin细胞、LY6G6C细胞、SPC24细胞和NKT细胞。同时，通过KEGG富集分析，作者比较了不同物种之间的免疫差异，也通过拟时分析研究了不同物种的外周免疫细胞发育轨迹。这些结果为研究不同生态位的龟免疫学奠定了重要基础。
参考文献
Guo R, Ma G, Zhai X, et al. Comparison of the Single-Cell Immune Landscape of Testudines from Different Habitats. Cells. 2022 Dec 12;11(24):4023.
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