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野生鸟类研究材料（数字化记录、组织样本）的收集保存和标本制作的方法 —BIO

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2024-12-07 04:21

摘要：野生鸟类的形态学数据和研究材料是研究现代动物系统学和进化生物学的重要材料支撑。尽管学术交流和样品共享是获得样品的有效渠道，野外采集仍然是目前获取野生鸟类研究材料的主要途径。随着生物多样性保护事业的发展，如何在不影响鸟类生存繁殖的前提下获取野生鸟类相关研究材料是本文探讨的主要问题。野生鸟类相关研究的主要研究材料分为标本、组织和数字化记录三大类。标本所含的物种信息、形态最丰富，组织可以用在分子生物学方面的研究，数字化记录可记录图像、声学多种信息。本文将对以上三种鸟类野外样品的获取和标本的采集制作做简要的总结和梳理。

研究背景: 鸟类是与人类关系及其密切的脊椎动物类群，它们出现在文人墨客的笔下“两个黄鹂鸣翠柳，一行白鹭上青天”，它们也出现在花鸟虫鱼的书画中，它们在天空中自由翱翔给人类带来飞翔天空中的梦想和灵感。大多数鸟类在消灭农林害虫和鼠害方面有特殊贡献，是维持自然平衡的积极因素。因而保护鸟类和研究鸟类成为世界上最为广泛、深入的专业性和群众性活动。这就多方面促进着鸟类科学的发展，使鸟类学成为生物学很多方面的先导学科，很多研究成果都推动着生物学理论的发展，在有关种的概念，性选择与进化，进化形态学，迁徙与定向等领域都是在鸟类学研究中获得新的发现然后在别的动物类群中得到验证(郑光美，2012)。现在世界上绝大多数鸟类种类被确认，种和亚种的分布图被精确绘制出，这就有可能从亚种进化水平以及细胞遗传、生物化学水平去探索系统分类和种进化的理论问题。现代动物系统学和进化生物学的研究涉及的类群越来越多。尽管多种分子生物学和基因组学的新方法和技术广泛运用，但没有大量的分布在不同地区的野生动物形态学数据和研究材料的支撑，我们无法在动物系统学和进化生物学的研究中取得巨大的进展。野生鸟类研究材料包括鸟类的影像资料，声音文件，这部分内容属于数字化记录的材料，可以运用在鸟类多样性、声景生态学方面的研究中；野生鸟类的研究材料也包括鸟类体重、体长、喙长等一系列形态学指标，这些指标可以用在鸟类身体状况的估计，从而应用在进化生物学、行为学、保护生物学、仿生学等研究上面(Blums et al.,2005; Dufour et al.,1991; Costantini et al., 2007; 陈坤, 2018)；野生鸟类的研究材料还包括鸟类的组织采样和标本的制作，组织样品包括鸟类羽毛、血液、肌肉、内脏等，这些材料由于包含有大量的遗传信息，在研究鸟类的种下支系分化和遗传格局研究谱系地理、生理生化、基因组以及不同发育阶段转录组信息(Nadeau et al., 2007; Beheregaray, 2008; Riddle, 2009; Ran et al., 2016; 周彤, 2019)有重要作用；除了以上提到的内容，对鸟类粪便的收集、体表寄生虫的获取、肛拭子和咽拭子采样、鸟窝、鸟卵等同样是属于野生鸟类研究材料。野生动物研究材料的获取，在很大程度上依然对动物学多个相关领域的发展有着巨大贡献。尽管学术交流和样品共享是获得样品的有效渠道，但野外采集仍然是目前我们获取动物样品和标本的主要手段。因此，作为鸟类系统学和进化生物学研究的基础，我们对鸟类野外样品的获取和标本的采集制作做简要的总结和梳理。

图1. 野生鸟类相关研究材料获取的流程图

一、野生鸟类相关研究材料
根据获取、保存和使用方式等的差异，可以将野生鸟类相关研究的主要研究材料分为标本、组织和数字化记录三大类。每一类的详细情况列表如下。

表1.野生鸟类相关研究材料的获取、保存及使用方式

细分类别获取方式保存方式使用方式可使用次数标本皮张捕获后制作干制，于标本馆长期保存查看、测量，可（有限次）取组织（趾垫、羽毛等）多次骨骼捕获后制作，或与皮张标本同时干制，于标本馆长期保存查看、测量多次器官捕获后制作，或与皮张标本同时浸泡于酒精等液体中，置于标本馆长期保存；或者在液氮中冷冻后，于-80 ℃冷冻保存查看、测量，可（有限次）取组织多次羽毛捕获后采集，或采集脱落羽毛干制，置于标本馆长期保存查看、测量多次鸟巢、鸟卵采集后制作干制，置于标本馆长期保存查看、测量多次组织肌肉捕获后采集浸泡于酒精等液体中，置于标本馆长期保存；或者在液氮中冷冻后，于-80 ℃冷冻保存对物质、组成、结构进行分析，消耗性有限次器官（如肝脏、脑）捕获后采集浸泡于酒精等液体中，置于标本馆长期保存；或者在液氮中冷冻后，于-80 ℃冷冻保存对物质、组成、结构进行分析，消耗性有限次血液捕获后采集，活体可放生浸泡于酒精等液体中，置于标本馆长期保存；或者在液氮中冷冻后，于-80 ℃冷冻保存对物质、组成、结构进行分析，消耗性有限次羽毛（如带血的羽毛根部）捕获后采集，活体可放生密封保存，或浸泡于酒精等液体中，冷冻保存对物质、组成、结构进行分析，消耗性有限次数字化记录图片非接触，野外拍摄，或获取标本后拍摄数字存储复制后直接使用无限次录像非接触，野外拍摄数字存储复制后直接使用无限次录音非接触，野外录制数字存储复制后直接使用无限次

这三类材料中，标本携带着物种、形态等方面的信息，并能提供少量的组织材料用于遗传分析，是所有材料中含有信息最为丰富的。另一方面，大量的不同年份的标本积累使其可以用于大尺度的时空分析，特别是在以往未曾注重组织材料收集的情况下，这些“历史标本”将会发挥越来越大的价值。
组织材料在近年来的研究中应用越来越广泛。例如可以用来研究鸟类的种下支系分化和遗传格局研究、谱系地理、生理生化、基因组以及不同发育阶段转录组信息。
随着生物多样性保护事业的发展，也给野生生物研究材料的获取提出了新的挑战，对于鸟类尤其如此。新颁布的《国家重点保护野生动物名录》中，大量增加了雀形目鸟类。这是保护鸟类的有效措施，但也给鸟类工作者、特别是依赖于标本和组织材料的研究者出了一个新的挑战：如何在不影响鸟类生存的前提下尽可能多地获取研究所需要的材料和信息？这个困难当然不是受限于技术，而解决之道却在于对新技术新方法的运用。将已有标本信息的数字化，以及野外鸟类的图片、录像、录音等的数字化记录就是这一类的信息获取方式。未来随着技术的发展，从历史标本和野外获取数字化的研究材料将会变得越来越普遍。现在也已经有学者通过采集柳莺的脚趾或羽毛样品，第一时间进行基因组DNA提取和鉴定，通过分析线粒体基因组结构和特征，得出几种柳莺的遗传发育关系密切程度(成贺，2020)还有学者通过粪便DNA技术对鸟类进行物种鉴定，对了解鸟类在繁殖地和越冬地的种类分布、研究其迁徙路线等具有重要意义。在新的挑战下，也可以通过野外收集的信息开展工作(秦啼，2020)。

二、野生鸟类相关研究材料的采集
首先要明确采集的目的，然后所有的人员、时间安排、材料的准备等工作都围绕采集目的展开。

野外采集准备
鸟类个体的野外观察、标本和样品的采集工作是开展鸟类学研究的最根本前提，是获取研究对象和研究材料的基本途径。充分而全面的野外采集准备工作是野外采集成功的关键。面对不同的鸟类采集任务，需要针对性的采集工具和方法。影像和鸣声资料获取鸟类采集
部分研究需要捕获鸟类以获取数据和材料。完成后可对状态较好的鸟体放生。若已经死亡或状态较差不能存活，则可将其制作成标本，并可大量获取组织材料等。具体请参考后文(4 野生鸟类死亡后的处理)。
在以往，科研人员可使用猎枪或弹弓等工具直接捕获鸟类，但现今使用枪支为非法行为，且该方法极易造成鸟体损坏，并存在严重的安全隐患，目前已不再使用，而较多使用陷阱捕获鸟类。因此后文将仅论述利用陷阱捕获鸟类的方法。非致死性获取鸟类组织材料
鸟类组织、器官、血液样品的采集主要取决于研究的需要。例如，进行分子系统进化和群体遗传学的研究仅需要采集少量的组织样品和血液样品。进行鸟类基因组水平的研究则需要采集新鲜的动物组织样品和血液样品，若操作得当，血液样品的采集一般不会造成鸟体死亡，因而可适用于受保护鸟类的研究中，现已广泛应用于各类研究。该部分所需实验器材列入（附表2）。野生鸟类死亡后的处理
野生鸟类在用各种方法捕获后，有可能造成死亡。这时可进行后续的标本制作和组织取样等处理。若需要制作标本和采集各种组织样本，而鸟体为存活状态，则需要将鸟类处死。一般采用胸部按压，使其尽快窒息而死。

三、野生鸟类相关研究材料的保存标本的保存和运输
对野外所得的标本，在搬运前都应一一检查，并理顺好羽毛，再将标本包裹好，整齐地放入箱里。装箱前应在箱体底部和内壁铺满棉花。每箱标本不能装太满，以免造成标本变形。如未能装满箱则可用棉花填满，以免在搬运时，标本间互相撞击损害标本。标本装箱时，应轻拿轻放，搬运时应尽可能减轻震动，以确保所有的标本都能完整无损的将它们搬运到实验室。运回的标本应及时开箱，将每号标本重新进行整理，理顺好被弄乱的羽毛，并放在阴凉处晾干(薛大勇等，2010)。
        经过旅途的搬运、颠簸，标本易受损坏。野外工作的繁忙、时间紧迫以及雨雪、阴天等的影响，标本往往来不及晾干就装箱托运。因此，带回来的标本必须及时从箱中取出，放在阴凉处晾干，以免受潮。
        在标本晾干之前，需对标本逐个的进行检查，对于那些在运输途中已变形，或使羽毛弄乱而使标本不整齐的，应努力整形和理顺标本。检查每个标本的标签是否系在腿上，如已脱落，应重新系紧在腿上。与此同时，对标签上的内容应认真检查，如有遗漏或错误，应查对野外记录本并及时补充和纠正。
        将制作好的标本系好标签后，在冷库中用超低温消毒3个月后再放入标本馆或者博物馆相应的储藏柜中。管理人员应经常对标本进行巡视，及时对出现变质、发霉的标本进行处理。组织样品保存
DNA分子分析成功与否取决于样品的采集与保存方法，因为DNA易在核酸酶、机械振动、过热、高湿和强光等条件的影响下发生降解。在野外采集的组织样品应及时放入-20 °C低温冰箱或-80 °C的超低温冰箱中，因实验需要，一些动物组织还应及时放入液氮中进行保存。
(1)血液样品保存
抽取血样之后，需要立即冷冻保存或放入盛有抗凝剂的取样管。在野外最好放在液氮罐里保存，回实验室后整理编号再放进低温冰柜里保存。
(2)肌肉和内脏保存
鸟类肌肉组织或内脏器官提取后，放进事先准备好的无水乙醇试管内。一般试管的大小根据研究的需要取2 ml或5 ml的试管即可。在野外可用常温保存，回实验室后整理编号后再放入低温冰柜里保存。新鲜组织样品最好每隔3天更换一次无水乙醇保存液，使保存液清澈透亮。
(3)粪便样品保存
粪便中的DNA易受水解、氧化和酶解等影响，加入粪样中的DNA拷贝数本来就很有限，因此，应尽可能地减少DNA的降解和污染。保存粪样的方法有5种：
1）干燥保存法：每次采集时要用一次性的手套，将粪便用塑料袋收集起来。然后将粪样在自然条件下干燥，干燥后，用塑料袋保存。
2）胶保存法：将粪样用塑料袋收集起来在粪样中加入硅胶（每克粪样4 g或8 g硅胶），在常温下保存（用滤纸将粪样和硅胶分开）。
3）低温保存法：将粪样用塑料袋收集起来直接放入干冰的密闭箱内或在液氮罐中保存，这比在常温下保存效果好的多。
4）DETS缓冲液保存法：将粪样直接放入盛有DETS缓冲液（20%二甲基亚砜，0.2 mol/l Na2EDTA，10 mmol/l Tris，pH 7.5，用氯化钠调至饱和）的塑料瓶中常温下保存。
5）乙醇保存法：将粪样样品直接放入盛有70%、90%或无水乙醇的塑料瓶中常温下保存。
(4) 羽毛样品的保存
可参考肌肉样品的保存，将羽毛放入盛有无水乙醇的试管中，最好也放入冰箱中保存。影像整理和保存
在野外考察和采集标本时，对所拍摄的每张照片和每段摄像均应记录以下主要内容，以便为将来室内照片的整理和研究论文的撰写提供可靠而真实科学的资料，没有野外记录的照片，往往是一张无用的照片。野外影像资料记录的内容包括：
(1) 摄影和录像的时间、地点和生境。
(2) 摄影和录像的动物种类名称和内容。
(3) 摄影和录像时的气候及温度。
(4) 在动物考察过程中都应加入考察者的镜头，作为今后科学研究和科普教育的重要的资料。
(5) 摄影或录像者的姓名。
首先对每张照片或录像应分门别类加以整理。整理时，要弄清所拍摄动物的确切种类，若一时无法确定种类，待以后标本鉴定后，再行标明该种动物的名称。对于每张照片或录像，应保存好原始资料，因现在的照片都会记录时间、地点、生境、海拔、气候，甚至光圈，速度等，所以保存好原始资料非常重要，能为科研工作带来很大帮助。然后将一些重要的照片打印或者冲洗出来，便于展示和做科普宣传。
应使用移动硬盘对野外的影像资料进行备份保存，同时将野外影像资料提交到博物馆的大型服务器，以供公共科普的教育和宣传使用。
        鸟类影像资料也应同时提交给博物馆，作为数字化标本数据存档。

致谢

感谢“第二界青藏高原科学考察与研究”国家自然科学基金项目(STEP No.2019QZKK0501)对本文的支持。

参考文献

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附表1

附表2

附表3

引用格式：董哲含, 贺鹏, 宋刚, 张尚明玉, 何兴成, 吴永杰. (2021). 野生鸟类研究材料（数字化记录、组织样本）的收集保存和标本制作的方法. Bio-101: e1010643. DOI: 10.21769/BioProtoc.1010643.