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第一章 T迷宫用于评估空间工作记忆
一、任务概述
二、不同版本T迷宫任务的比较
三、实验动物
四、实验设备
五、实验方案
A.奖赏交替任务
B.自发交替任务
六、问题与解决方案
七、讨论
八、不同迷宫的简单比较
第二章 T迷宫用于评估决策行为
一、任务概述
二、实验设备
三、基于延迟和努力的自动T迷宫决策分析方案
四、评价指标与统计方法
第三章 评估大/小鼠空间工作记忆和参考记忆的Y迷宫实验方案
一、任务概述
二、实验材料
三、实验方案与评价指标
全文25000字+，Y/T迷宫实验少走弯路
第一章 T迷宫用于评估空间工作记忆
一. 任务概述
记忆可以广义地定义为先前获取的信息的持久性，其可以细分为不同的子系统。根据记忆的持续时间，我们可以区分短期记忆（STM）和长期记忆（LTM），短期记忆的范围从几秒到几分钟不等，长期记忆的特征是持续几天、几年甚至几十年。“工作记忆”一词的概念与STM的概念部分重叠，但工作记忆实际上更具体地指的是存储信息并允许其操纵以指导决策和行为的认知缓冲器。它的容量和持续时间是有限的。工作记忆的可用性与特定任务的执行密切相关。另一方面，根据记忆的内容，同样可以分为几个亚型，包括视觉、听觉、触觉、嗅觉、味觉、互感和空间。特别地，空间工作记忆指定执行特定行为所需的临时空间信息。工作记忆能力下降，可出现空间定位困难等症状，参考记忆（主要指长期记忆）能力下降可出现新知识学习能力下降等症状。
动物认知模型（学习和记忆）在神经退行性疾病的治疗发展中具有重要的价值。因此，发展合适的认知范式是必要的。Tolman于1925年首次报道说，大鼠会避免重复进入迷宫的一个臂。自发交替行为首先是在T迷宫中定义的，当大鼠进入了迷宫的一个臂，在下一次试验时会进入对侧的臂。有人提出，大鼠在探索了第一只臂后，会产生一种内部抑制感，导致不愿在随后的选择中再回到那只臂。选择与之前不同的臂增加了动物寻找到食物的机会。随着时间的推移和在复杂的环境中，以这种交替的方式做出反应可以大大增加获得的食物数量，减少时间和能量消耗。交替策略是一种适应性优势，使用的是“工作记忆”。由此发展来的T迷宫交替任务是一种广泛用于评价空间工作记忆能力的行为实验方法。
交替反映了动物探索其环境和定位资源存在的动机，如食物、水、配偶或庇护所。动物不需要被剥夺这些资源来表现出交替行为，在这种情况下，为自发交替T迷宫任务。若交替倾向通过使动物饥饿，在任务中用食物奖赏来强化，则为奖赏交替T迷宫任务。T迷宫是一种以水平放置的高架或封闭的T型装置，包括一个起始臂和两个目标臂。基于啮齿类动物的交替倾向，这促使它们在重复的试验中交替选择目标臂。在采样试验中做了一个选择后，那么在第二个试验中以前没有探索过的臂将是首选。在第三次试验中，两个目标臂都曾进入过了，那么新奇程度最高的臂（在较长时间前探索的臂）是首选。在任务期间，为了在试验中成功地交替选择，动物必须记住在前一次试验中进入过哪个臂，这使得T迷宫交替任务成为空间工作记忆的最佳测试。自发交替和奖赏交替对各种脑损毁的影响很敏感，特别是海马功能障碍，也特别适用于研究许多能增强或损害空间记忆的药物或毒素的影响。
二. 不同版本T迷宫任务的比较
目前已经开发了不同版本的T迷宫任务，可以根据测试的关键特征进行区分：
1. 自发交替与奖赏交替：与自发交替版本不同，奖赏交替版本是正确的交替会得到系统的奖赏。在该版本中，之前的试验中没有探索过的臂是用奖赏食物来诱导探索的。这种交替行为不是自发的，而是由食物奖赏强化的。与奖赏交替版本相比，自发交替版本有几个优点。首先，它依赖于啮齿动物的自发行为，而不是训练过的行为，而且不受实验者强加的动机来源的影响。此外，自发交替不需要食物限制，因此对动物来说压力更小。最后，自发交替更节约时间，因为它可以在一次测试中完成，而奖赏交替在测试开始前仍需要几天时间，首先一段时间的食物限制是必要的，以及对奖赏食物和迷宫的适应时间。值得注意的是，在检测认知障碍方面，自发交替版本似乎也比奖赏交替版本更敏感。例如，乳头体损毁的小鼠在试验间间隔（ITI）为30 s的条件下，能在自发交替中检测到任务表现下降，而在奖赏交替中未发现。通过增加ITI（达到50和180 s）来增加任务的难度，发现对于奖赏交替，认知障碍仅在ITI为180 s时出现。此外，隔区损毁导致T迷宫表现的降低，对于奖赏交替是短暂的，可以在测试期间恢复，而对于自发交替，表现降低是持续的和不可恢复的。此外，自发交替或奖赏交替的选择也取决于实验的要求。如果需要为每只动物收集大量数据，而且时间很短，那么奖赏交替是更好的选择，因为如果动物因为食物限制没有饱腹感，每天可以进行20次甚至更多的试验。自发交替的速度较慢，因为动物在进行过两到三次试验后通常需要花费更长的时间去选择，一天内可以完成的试验更少。
2. 离散试验与连续试验：在离散试验版本中，每次试验都是分开的，动物每次都需要回到起始臂再开始。在连续试验版本中（通常使用T迷宫的变体Y迷宫，三个臂形成三个相等的120°的夹角），动物在迷宫中自由探索一定的时间或一定的入臂次数后结束。连续版本Y迷宫有两种评分方式：一种是每次动物选择进入前一次试验中没有进入的两个臂之一，记为一次正确交替；只有重新进入刚刚离开的臂才记为错误。另一种方法是当连续依次探索三个臂时记录一次交替评分。前两次入臂可以看作采样。对于之后所有的入臂情况，如果所选的臂在其之前的两个试验中均没有进入，则记为一次交替。例如，如果这三个臂被命名为A、B和C，在B-A-C-A-B序列中代表有两次交替。连续交替任务的优点是避免了在试验之间实验人员对动物的接触可能产生的压力。但连续版本的一个很大的限制是，它可能无法检测到海马功能障碍。由于海马损毁经常导致单侧偏好（总是向左或向右），在连续版本中测试结果显示这些动物似乎有正常记忆，任务表现正常（两种评分方式均无法检出），而T迷宫的离散版本可以正确地显示出它们有一个非常低的交替率（通常明显低于随机水平50%）。RobeT Gerlai在T迷宫中开发了一种连续交替程序，避免了连续交替Y迷宫的低敏感性。然而，与T迷宫的离散试验相比，这两种连续试验都有限制，即入臂时间不受控制，此外，ITI不固定，也无法控制。使用固定的 ITI尤为重要，因为空间工作记忆是延迟时间相关的。事实上，随着ITI从0 s到600 s，正确的交替次数逐渐减少。此外，在离散试验过程中，ITI可以作为实验变量进行操作，以增加任务的多样性。在某些情况下，认知障碍在较短的ITI时检测不到，但在较高的ITI时出现。例如，社会挫败压力导致90 s ITI时的自发交替受损，但60 s或30 s的ITI时未检测到自发交替的变化。认知增强效应也可能是延迟时间依赖的。例如，莫达非尼在长ITI（60和180 s）时提高了交替率，但在短ITI（5 s）时没有提高。
3. 封闭迷宫和高架非封闭迷宫：测试可以使用一个高架T迷宫或一个封闭T迷宫来进行。啮齿类动物在封闭臂中往往不那么焦虑，而且更愿意探索，而且很快就能适应封闭的迷宫。理想情况下，迷宫的宽度大约是啮齿动物身体宽度的两倍。非常有限狭窄的空间是厌恶的，而宽阔的迷宫像一个开阔的场地，这也是啮齿动物厌恶的，所以如果迷宫宽度更窄或更宽，它们可能会感到焦虑。此外，大鼠和小鼠的趋避性意味着宽阔的迷宫会使啮齿动物在选择点时偏离中心，这可能会影响选择行为。而高架非封闭T迷宫会让啮齿动物产生焦虑，在开始之前通常需要多次适应实验，以便让动物熟悉这个装置。这正如高架十字迷宫，它有两个开放臂和两个封闭臂，啮齿动物更喜欢封闭臂，大约75%的时间在封闭臂中，25%的时间在开放臂中。此外，对于一只健康的大/小鼠来说，它很容易通过张开的臂跳跃来逃离设备。除非你想强调迷宫周围的空间线索，否则尽量不要使用高架T迷宫。封闭T迷宫节省了适应时间，是研究空间工作记忆的一个更好的选择。
三.实验动物
T迷宫任务可用于大鼠、小鼠、沙鼠、猪、绵羊、山羊、乌龟和鸽子等。对于大鼠和小鼠来说，有空间组织的测试通常学习得很快，并且执行得非常准确。相比其他品系，C57BL/6小鼠被广泛认为更适合进行行为任务，但大多数近交繁殖品系也表现良好，如白化小鼠NMRI、CD-1等。129S2Sv小鼠，或具有较多129遗传背景的转基因小鼠，最好避免使用。Hooded Lister大鼠是理想的实验动物，但白化品系的Sprague-Dawley或wistar大鼠也表现得相当好，但可能在迷宫中行动速度会慢一些。至于每组动物的数量，这可以是非常灵活的，因为该测试可以重复很多次，以增加数据量。因此，如果你有10只对照组大鼠和10只损毁组大鼠，并且只是想知道两组是否有差异，每只大鼠进行5次试验通常就足够了。其实，T迷宫交替任务也可以用来量化单个啮齿动物的表现。例如，你可能希望检查在一组海马损毁的大鼠中，每只大鼠是否都有明确的功能损伤。为了评估单个动物的表现，可能需要20+个试验/大鼠。如果动物的适应程度良好，每次试验通常只需要1-2 min。
四. 实验设备
实验设备是一个封闭T迷宫或一个相同尺寸的高架T迷宫。手动运行的T迷宫很容易构建，但也是相当劳动密集型的。不过，现在也开发出自动T迷宫，可以商业购买。T迷宫包括两个目标臂和一个与之垂直的起始臂或称主干臂。图1展示了一个T迷宫的平面图。表1展示了适合大鼠或小鼠的T迷宫尺寸。起始臂的宽度应适用于配有中心分区进行自发交替的迷宫。如果只将迷宫用于奖赏交替，则10厘米的宽度能使大鼠更快速地转向目标臂，从而获得更好的本体感觉反馈和任务表现。建议小鼠的起始臂宽度设计为7厘米。在封闭迷宫中，对于小鼠，墙壁应为20厘米高；对于大鼠，应为30+厘米高。目标臂之间应包括一个可拆卸的中央隔板，使动物在采样阶段一次只能进入一个目标臂。如果没有这个隔板，动物可以在第一个采样阶段对另一个臂进行部分采样，这可能会对选择阶段造成干扰。T迷宫已经使用了一个多世纪，已经尝试了许多设计。例如，一些研究人员选择设计一个单独的起始盒或可关闭的目标盒使其与目标臂分开。虽然目前T迷宫的设计是简单通用的，但若试图复制其他研究人员的工作结果，建议一定要精确地复制他们的迷宫设计。迷宫可以由灰色或黑色的油漆木材、中密度纤维板（MDF）或聚氯乙烯（PVC）等塑料制成。把迷宫漆成灰色或黑色的原因是啮齿动物倾向于避开明亮的地方，比如白色的地板。一个白色的迷宫可能会引起焦虑，从而适应的速度也会更慢。黑鼠可以选择浅灰色迷宫，白鼠可以选择灰色或黑色迷宫。对于高架T迷宫，平面图与封闭T迷宫的尺寸相同。对于小鼠，一般将迷宫安装在离地面至少30厘米的架子上；对于大鼠，一般安装在离地面至少60厘米的架子上。强烈建议在高架T迷宫周围安装透明的有机玻璃或黑色矮墙，以减少动物的焦虑并且防止它们掉落。对于小鼠，矮墙高度可设置为1厘米高，大鼠可设置为3厘米高。
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图1：T迷宫平面图。尺寸为厘米：R =大鼠，M=小鼠
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表1：T迷宫尺寸（长度×宽度）汇总。所有的单位都是厘米
五. 实验方案
在开始T迷宫任务之前，应确定入臂标准。一般来说，每次试验选择的标准是整个动物（包括尾巴尖）均进入目标臂内。一些研究人员可能也会选择使用其他标准，比如四只脚进入目标臂，或者只使用两个前足进入作为标准，但建议包括尾尖，因为当所有四只脚都进入一个目标臂时，动物仍会犹豫并可能纠正自己的选择（其实也证明大鼠正在识别，即认知过程正在发生）。值得注意的是，当它们最终进入正确的目标臂时，它们会迅速移动到臂的远端。因此，这个包括尾尖的标准可能是最敏感的。但无论采用哪种标准，只要严格遵守，就应该不会存在实验者偏倚的问题。但为了完全避免实验者偏倚的可能性，采取实验者对动物分组的盲法是可取的。这很容易实现，例如，通过在药理学研究中将药物治疗进行编码，最好是由行为训练人员以外的人来管理。
如果执行奖赏交替任务，请遵循下面的选项A。如果进行自发交替任务，请遵循下面的选项B。
A．奖赏交替任务
1. 实验程序
(1). 抚摩：把你的手放进饲养笼里，慢慢地让动物适应你的触摸，先不要一开始就把它们拿起来。双手合拢成杯状托住一只动物，轻轻地握紧一点（或者通俗点说放在手里轻轻rua几下）。把它们托起来，过一会儿再把它们放回笼子里，不要抱太久；或者如果它们变得激动也要及时放回笼子里。最好地让动物适应抚摩的方法是抓住它们的身体而不是尾巴，并逐渐增加抚摩的时间。如有必要，间隔5 min重复几次。一定要有足够的间隔，把它们放回笼子里使它们再次变得平静。适应是很重要的一步，除非它们都很适应和放松，否则它们不会把任务学得很好。
(2). 在饲养笼里给动物喂实验时用的奖赏食物，使动物在熟悉的环境中适应奖赏食物的味道，以避免面对没吃过的新食物而产生的低食症，因为啮齿动物对于吃新东西很警惕。关于给它们的确切的数量在此阶段并不重要：对于大鼠，大约每只给予20颗奖赏食丸；对于小鼠，大约每只2毫升奖赏牛奶。在光暗循环的黑暗阶段开始前一小时，将食物盛在一个小盒子里，放进饲养笼。（注意找一个合适的容器以免垫料大量混进食物里）。
(3). 食物限制。食物限制对于增加和维持大/小鼠执行T迷宫任务的动机至关重要。称重每只动物并记录，在饲养笼内定量配给啮齿动物专用食料。关于喂食量，对于小鼠，大约1.5克/只；对于大鼠，约5克/100克体重。把食物掰成小块，这样可以尽量避免某些动物垄断食物。使每只动物保持在其自由喂养体重的85%以上，90-95%是最理想的。如果实验时间持续一周以上，并且动物还没有完全长大，一定要确保它们的体重按照正常的生长曲线有规律地增加；不能将体重保持在初始自由喂养体重的固定百分比。在测试和训练期间，每天给实验动物称重，以监测健康状况和食物限制程度，允许大鼠在限制饮食下每周增长5克体重。考虑到动物福利伦理，我们建议限制饮食时不应导致体重下降到自由喂养体重的85%以下。如果体重在自由进食体重的85%时还没有动力进行任务，这可能意味着适应地还不够。动物适应得越好，就越不需要定量配给来促使动物顺利进行迷宫任务。训练有素的动物即使吃了很多正常饲养食料，在迷宫中也会行动以寻求奖赏食物。单笼饲养虽然可以更好地控制每一只动物的体重，但是这种社交隔离也会增加动物的应激和焦虑。
(4). 试验前准备：在任何行为任务中，动物应该处于测试的最佳唤醒状态。把它们带进测试室后，让它们待一个小时。如果立即进行测试，它们就会过度兴奋，不集中注意力。相反，也不要让它们待一个小时以上，否则它们可能会睡觉。
(5). 适应和训练试验
首先适应动物，如下文（i）（ii）（iii）所述。当动物被单独放在迷宫中时，能够毫不犹豫地探索，并且没有过度排便或排尿，代表动物适应良好, 这通常是在训练后的4天内达到。可以先用迷宫样的设备适应，逐步再用真正的T迷宫适应，尤其是当动物看起来很紧张时最适合这样逐步适应。一旦这些动物适应了，通常每天进行10次试验。下文步骤（iv）采样试验和步骤（v）测试试验为一对匹配训练。一次匹配测试后将动物放回饲养笼。即第一只动物测试完，随后这一组的动物依次进行它们各自的第一个匹配测试，然后进行下一轮。每个试验的采样目标臂由随机序列确定，每个动物和每个测试阶段都有不同的序列。连续相同臂的最大数量为三个，以防止养成位置定式的习惯。合适的随机序列可以由计算机生成。
（i）让动物适应迷宫样的环境。(A) 对于封闭迷宫的预适应，可以用一个巷道装置，类似迷宫的一个臂。让动物从装置的一端跑到另一端，在那里放有充足的奖赏食物，并允许它们喝或吃掉所有食物。如果事先进行了很好的抚摩适应，每组使用3分钟的适应试验，然后进行下一组。大多数动物在六次试验之内就能实现在装置中大胆跑动。(B) 对于高架迷宫的预适应，由于迷宫的高度和缺乏高墙所引起的更大的焦虑，将需要更多的适应。特别是对于小鼠，它们在升高的环境/迷宫中更不容易进食。因此，在高处训练之前，在封闭环境中的过渡训练可能是必要的。这样它们就不会像是直接从饲养笼到高架十字迷宫的开臂一样跨度那么大。接着，非常建议让它们先在一个有食物的中等高度的平台上适应。对于小鼠，一个大约30 ×10厘米的矩形平台，可以用于群体适应，把同一笼的都放上去。对于大鼠来说，一个50厘米的正方形会是一个合适的平台大小。当所有的大鼠/小鼠都能在平台上吃东西时，就可以在此平台上单独适应它们，然后再去适应T迷宫本身。
（（ii）在进行奖赏交替测试之前，动物必须适应T迷宫。最好的方法是将所有闸门都打开，沿着迷宫放一些奖赏食物，并把整个饲养笼里的一组一起放进迷宫适应大约3 min。在迷宫中让同一笼的动物一起探索，会让它们在探索的初始阶段更舒适，并减少每只大/小鼠适应迷宫所需的时间。如有必要，可以及时补充奖赏食物。这样大约四次（如果它们吃食物的速度很慢可以进行更多次），适应间隔时间至少为10 min。T迷宫适应期应该只需要1天或2天。可以再持续适应两天，一天只把食物放在迷宫的臂上，然后第二天只放在臂的末端。
（iii）最后适应是将其中一个目标臂的闸门关闭，让单个动物从起始臂开始行动，在左右两个臂进行相等数量的适应。
（iv）在采样和测试试验中均使用奖赏食物进行强化。采样试验中，关闭一侧目标臂，将动物放在起始箱域，强迫动物进入另一侧目标臂，吃掉所有的奖赏食物。实验者如果需要在现场，那就站在起始箱的中央，这样实验者的身体位置就不会影响动物的臂选择。
（v）当动物吃完所有的奖赏后，把它放回起始臂的末端，将其限制在起始位置一段设定的时间（从0 s到几分钟都可，5 s是理想的时间），每次和每只动物都使用相同的时间。较长的等待时间会增加任务难度，也就是说，增加了动物必须记住它最后进入了哪只臂的时间长度。之后开始测试试验。这次将两个目标臂的闸门都打开，并只在采样实验中被阻挡的那个臂上放置奖赏，小鼠的标准奖赏一般是用1毫升注射器或固定吸管提供的0.07毫升的1：1（vol/vol）水/全脂甜炼乳，大鼠的标准奖赏是两个45毫克的奖赏颗粒。在起始箱让动物背对目标臂（如果起始箱通过加装闸门设置了起始箱，则将动物放入起始箱即可，然后再打开闸门），然后允许它自由选择一个臂。如果选择正确，给予充足时间让它们吃完所有食物。如果选择不正确，只需关闭目标臂的闸门来限制动物一定时间后再将其移出，以确保动物能发现该臂是没有奖赏的。限制的时间相当于正确反应中的进食时间。因此，这是一个非修正程序。
（vi）当动物表现稳定且选择准确性高时（训练达标标准是工作记忆错误小于15%）开始进行给药测试或脑区损毁研究。或者，也可以研究药物或脑区损毁对学习这项任务的影响，那给药和损毁需要在训练前进行。
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图2：奖赏交替任务
2. 评价指标与数据分析：记录进入食物强化臂的次数（正确选择）和再次进入非强化臂的次数。反复进入一个无奖赏的臂被认为是一种工作记忆错误。将数据表示为：(1).柱状图，显示为在给定的测试期间对照组、脑损毁组或药物测试组的平均正确选择百分比 (单因素：分组)，或 (2).直线图，比较每组及每天测试阶段的正确选择百分比（双因素：分组和测试日）。对于包含少量试验的实验，可以计算每只动物的正确百分比，并使用成对对照组与处理组的t检验比较或多组比较的ANOVA分析结果数据。对于较长时间的实验，将数据分割成合适的试验块，并执行重复测量方差分析。此外还可以记录选择潜伏期，潜伏期反映动物的运动能力和对任务执行的积极性。
3. 时间：每次试验的时间应不超过2 min。正常健康的大鼠将在7到10天内准备好进行任务训练（包括足够的食物限制和充分适应T迷宫），而且在训练时几乎每次都能完美地完成这项任务。一只健康有动力的大鼠应该在5天内达到任务标准。
4. 注意事项
(1). 在训练过程中，即在给与任何处理因素之前，如果一只动物在90 s内没有沿迷宫移动，请将其移除，然后过一会儿再试一次。经验表明，这是对付那些不动的动物的最好方法。如果将它们继续留在迷宫中，希望最终它能动起来，可能会浪费很多时间，而且动物往往变得更加焦虑，这种焦虑将会与迷宫联系在一起，可能会造成恶性循环，动物更不愿意动了。最好的办法是取出动物，重新让它在不同环境下适应奖赏食物，首先在饲养笼里，然后在不同的新环境中，最后再在迷宫中适应。然而，如果动物在已经给与处理因素后（比如给药或脑区损毁）发现不动，那90秒的时间限制是中止试验的合理标准。然后，可以将这种失败的试验次数与对照组的失败试验次数进行比较，并得出关于处理因素对动机的影响的结论。
(2). 每次试验通常只需要一分钟多一点的时间。如果动物没有迅速吃完奖赏，就代表它们没有进行足够的适应/训练，动机不足，将很难阐明结果反映认知方面而不是动机/训练方面的程度。
B．自发交替任务
自发交替任务是基于这样的现象，即啮齿动物以交替的方式探索它们的环境，即使探索没有得到食物的奖赏，啮齿动物仍对环境有探索动机。该任务的正常交替表现需要完整的工作记忆能力。药理学操作或脑区损毁通常是在测试自发交替任务之前进行的。该任务与奖赏交替类似，除了没有对迷宫进行适应，而是利用迷宫的新奇性驱动动物的自发探索/交替。该方案全程允许大/小鼠自由选择目标臂，在第一个采样试验中不像在奖赏交替那样需要设置强迫选择。因为这些动物的动机只是它们探索迷宫的欲望（也就是说，它们没有限制饮食），所以，动物必须对实验者和实验环境完全适应，没有恐惧感。
