宠物跳蚤皮炎疫苗的研制及其免疫效力评价
宠物跳蚤皮炎疫苗的研制及其免疫效力评价
【摘要】： 跳蚤过敏性皮炎(Flea allergy dermatitis,FAD)是由跳蚤叮咬引起的一种世界范围性的皮肤病,能够引起犬、猫等动物皮炎、剧烈的瘙痒、抓挠导致的二次感染,不仅危害动物的健康,同时也给畜主造成一定的经济负担。猫桎首蚤分布最广,无明显的宿主特异性,是引起所有哺乳动物甚至是人类以及部分鸟类严重危害的主要蚤类,研究猫桎首蚤引起的过敏性皮炎具有十分重要的临床意义。猫桎首蚤的唾液中含有多种的过敏原蛋白,使被叮咬动物产生过敏反应,其中最重要的一种是跳蚤唾液抗原1(Flea saliva antigen 1,FSA1)。目前的研究表明,共免疫跳蚤唾液抗原和与之编码相匹配的核酸疫苗能够诱导产生调节性T细胞,引起免疫抑制。本课题在前人研究的基础上,发明了一种高效、快速的r FSA1表达纯化工艺,并利用共免疫方法评价宠物皮炎疫苗对猫跳蚤叮咬引起的过敏性皮炎防治效果。为了制备宠物皮炎疫苗,人工合成目的基因FSA1分别克隆至p ET28a和p VAX1质粒载体,重组质粒p ET28a-FSA1用于转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞获得重组菌BL-FSA1,重组质粒p VAX1-FSA1用于转化E.coli DH5α感受态细胞获得重组菌DH-FSA1;将BL-FSA1破菌提取包涵体,分别进行包涵体的粗纯化、精纯化、复性、去除内毒素等步骤得到r FSA1;将DH-FSA1利用碱裂解法大量提取质粒,去除内毒素后得到p VAX1-FSA1,将纯化的r FSA1和重组质粒p VAX1-FSA1联合使用作为宠物皮炎疫苗。为了能够客观的评价宠物皮炎疫苗,我们构建了猫FAD模型,每只猫攻100只跳蚤,48 h后饲喂除蚤药除蚤,间隔12 d,重复以上步骤4次,用一个量化的皮炎评分标准评价发病程度。采血,测定外周血T细胞增殖活力,Ig E抗体水平,嗜酸性粒细胞比率。结果表明猫FAD从第三轮攻跳蚤后评分迅速增加,第4轮攻跳蚤即可达到最高值6.0分左右,攻更多次数的跳蚤并不会增加皮炎的评分,第4轮后停止攻跳蚤皮炎评分能维持在4.5~6.0分45 d以上;与空白对照组相比,T细胞增殖水平显著升高,特异性Ig E水平也逐渐增加,嗜酸性粒细胞比率达到10.6%。因此,可以确定成功诱导了猫FAD模型,此过敏性皮炎模型可以对宠物皮炎疫苗的防治效果进行客观评价。为了评价宠物皮炎疫苗对猫FAD的治疗效果,我们首先建立了猫FAD模型,然后对其进行两次免疫。结果发现共免疫组的猫皮炎临床症状得到迅速改善,皮炎评分从5.7分下降到了1.6分,T细胞增殖受到抑制。以上结果证明了共免疫r FSA1+p VAX-FSA1的方法能够抑制过敏性皮炎,对猫FAD有显著的治疗效果。为了评价宠物皮炎疫苗对猫FAD的预防效果。我们首先对其进行两次免疫,然后攻跳蚤诱导猫FAD。结果显示经过4轮攻跳蚤,共免疫组的猫皮炎评分(1.9分)显著低于FAD对照组(5.5分),T细胞增殖受到抑制。说明共免疫r FSA1+p VAX-FSA1能抑制FAD临床症状,有显著的保护效果。本研究成功建立了猫的FAD模型,证明了宠物皮炎疫苗对猫跳蚤叮咬引起的过敏性皮炎的具有显著的防治效果,共免疫重组蛋白r FSA1和质粒p VAX-FSA1可以作为防治猫FAD的良好办法。该研究的成果有助于FAD的临床防治和为其它过敏性疾病的防治提供有价值的参考。
【学位授予单位】：华南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
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