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2023年山东省局部地区宠物源碳青霉烯耐药菌的流行分布特征

萌宠菠菠乐园
2025-01-17 01:30

摘要

碳青霉烯类抗生素是抗菌谱最广的抗生素，碳青霉烯类抗生素是抗菌谱最广的抗生素，因其具有对β-内酰胺酶稳定以及毒性低等特点，已经成为治疗严重细菌感染最主要的抗菌药物之一。近年来，随着社会的进步，有宠家庭不断增加，宠物行业也不断发展，近年来的研究数据也表明碳青霉烯耐药菌在宠物行业的检出率大大提升，但碳青霉烯类抗生素并未被批准用于兽医临床方面。宠物源碳青霉烯耐药菌检出率的升高严重威胁了宠物和饲主的健康与安全。

针对此问题，在2023年期间，对山东省局部地区：德州，济宁，青岛，聊城和泰安等地的多家宠物医院以及宠物店的犬猫进行肛拭子的采集，通过细菌的分离与鉴定，对筛选出来的blaNDM呈阳性的菌株进行药敏实验以及耐药基因检测。结果总共筛选出山东省局部地区宠物源碳青霉烯耐药菌株总共33株，其中德州获得的菌株有1株，济宁获得菌株0株，聊城获得菌株25株，青岛获得菌株1株，泰安获得菌株6株。总共有32株来源于犬，1株来源于猫。

通过对致病菌株进行统计，可以观察到聊城和泰安采集的样品中blaNDM呈阳性的菌株检出率比较高，德州，济宁和青岛采集的样品中检测到的blaNDM呈阳性的菌株检出率很低。该研究通过对山东省局部地区宠物源碳青霉烯耐药菌的流行分布特征的研究和调查，统计出2023年山东省局部地区宠物源碳青霉烯耐药菌的流行分布状况，以便对碳青霉烯耐药菌进行有效的防控。此外，对碳青霉烯耐药菌的流行分布特征以及抗药性的调查，可以为指导兽医临床抗菌药物的使用提供一定的指导意义。

关键词：碳青霉烯耐药菌；宠物源；流行分布特征；细菌的分离与鉴定

Abstract

Carbon cephalosporins are the antibiotics with the broadest spectrum of antibacterial activity. Due to their stability against β-lactamases and low toxicity, carbon cephalosporins have become one of the main antimicrobial drugs for the treatment of severe bacterial infections. In recent years, with social progress and the increasing number of pet households, the pet industry has been continuously developing. Research data in recent years also indicate a significant increase in the detection rate of carbapenem-resistant bacteria in the pet industry. However, carbon cephalosporins have not been approved for veterinary clinical use. The increased detection rate of carbapenem-resistant bacteria from pets poses a serious threat to the health and safety of both pets and pet owners.

To address this issue, during the period of 2023, rectal swabs were collected from dogs and cats in several pet hospitals and pet stores in specific regions of Shandong Province, including Dezhou, Jining, Qingdao, Liaocheng, and Tai'an. Bacterial isolation and identification were conducted to screen for blaNDM-positive strains, followed by antimicrobial susceptibility testing and detection of resistance genes. A total of 33 carbapenem-resistant bacteria strains were screened in the targeted regions of Shandong Province, with 1 strain from Dezhou, 0 strains from Jining, 25 strains from Liaocheng, 1 strain from Qingdao, and 6 strains from Tai'an. Of these, 32 strains were from dogs, and 1 strain was from a cat.

By analyzing the pathogenic strains, it can be observed that the detection rate of blaNDM-positive strains was relatively high in the samples collected from Liaocheng and Tai'an, while it was very low in the samples from Dezhou, Jining, and Qingdao. This study investigated and surveyed the epidemiological distribution characteristics of carbapenem-resistant bacteria from pets in specific regions of Shandong Province in 2023, in order to effectively prevent and control carbapenem-resistant bacteria. Additionally, investigating the epidemiological distribution characteristics and drug resistance of carbapenem-resistant bacteria can provide guidance for the use of antimicrobial drugs in veterinary clinical practice.

Keywords:carbapenem-resistant bacteria;pet sources; epidemiological distribution characteristics; isolation and identification of bacteria

2023年山东省局部地区宠物源碳青霉烯耐药菌的流行分布特征

前言

1.1动物群体中的流行现况

相对于人医临床，碳青霉烯耐药菌株在伴侣动物中的报导相对较少，而近年来在食品动物养殖行业中的研究和流行分布情况受到广大学者的关注，但越来越多的研究显示动物源的碳青霉烯耐药基因库不断扩大。

宠物源碳青霉烯耐药菌的报导最早来源于美国，2008~2009年期间在美国多个兽医临床实验室收集到的994株来源于犬猫的大肠杆菌样本中，检出6株NDM阳性，虽然仅有一株能够发生接合转移；2013年在中国农业大学教学宠物医院采集的226份肛拭子和137份鼻拭子中分离到携带blaNDM-1的ST167型大肠杆菌；2019年，在美国费城的一家宠物医院中在宠物的气管中分离出来了一株携带blaNDM-5的ST167型的大肠杆菌；同年，位于英国的一家宠物医院在伴侣动物的191份采集样本中，从一只患有多种疾病并且使用过多种抗生素的施普林格猎犬的伤口中分离到一株blaNDM-5的大肠杆菌；2020年韩国研究人员曾在不同地区的四家宠物医院中分别发现了四株携带blaNDM-5的ST410型大肠杆菌，这些研究表明韩国blaNDM-5的ST410型大肠杆菌可能在宠物行业中广泛传播；在中国广东省的几家宠物医院的样本中分离到了四株携带blaNDM-5的大肠杆菌，其中有三株携带blaNDM-5的ST410型的大肠杆菌，一株携带blaNDM-5的ST9437型的大肠杆菌。[1]

尽管，目前为止在伴侣宠物行业中关于碳青霉烯耐药菌的研究和报导并不宽泛，但近年来的研究表明宠物源碳青霉烯耐药菌的检出率逐渐增大，在伴侣宠物的健康和安全中存在一定安全隐患。

1.2碳青霉烯类抗生素的抗菌机制

目前为止，碳青霉烯抗生素抗菌谱最广、抗菌活性甚强的一类抗生素，其对多种β-内酰胺酶高度稳定，对头孢菌素耐药菌仍可发挥优良抗菌作用。细菌对该类药物不存在交叉耐药性，因而对革兰氏阳性菌、阴性菌及厌氧菌都有强大的抗菌活性。目前，国内上市的碳青霉烯类抗生素药物有：亚胺培南，美罗培南，帕尼培南，厄他培南，比阿培南，多尼培南等。亚胺培南、美罗培南、帕尼培南对大多数革兰阳性、阴性需氧菌、厌氧菌及多重耐药菌均有较强的抗菌活性，但耐甲氧西林葡萄球菌、屎肠球菌、嗜麦芽寡养单胞菌等对本品耐药。碳青霉烯类抗生素的抗菌机制是药物穿透细菌细胞壁并与青霉素结合蛋白（Penicillin binding proteins,PBPs)结合，通过抑制细胞壁粘肽合成酶，导致细胞内自溶酶抑制剂失活，从而阻碍细胞壁粘肽合成使细胞壁受损，菌体膨胀致使细胞浆渗透压改变和细胞溶解，最终导致细菌的死亡。由于哺乳动物无细胞壁不受此类药物的影响，因而本类药物具有对细菌的选择性，杀菌作用对宿主毒性小的优点。

1.3碳青霉烯类抗生素的耐药机制的产生

耐药菌的出现总是伴随着新型抗生素的产生，虽然碳青霉烯类抗生素并未应用于宠物行业临床治疗方面，但是由于多种抗生素的滥用和联合使用以及在人类医学卫生领域的广泛使用，伴侣宠物中也逐渐出现了碳青霉烯耐药菌。目前，临床主要致病菌对碳青霉烯类的耐药很少见，耐药机制主要有；①产碳青霉烯酶，水解碳青霉烯类药物;②产AmpC或超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）等水解酶，通常辅以孔道蛋白缺失或表达降低而导致的外膜通透性降低;③青霉素结合蛋白（PBP）对碳青霉烯类药物亲合力下降;④药物外排泵高度表达。[2]

1.3.1产碳青霉烯酶

细菌所产生的碳青霉烯酶包括A类β-内酰胺酶；A 类丝氨酸碳青霉烯酶（非金属 β-内酰胺酶）；D类β-内酰胺酶，又称苯唑西林酶（OXA酶）；B类β-内酰胺酶（MBLs），其活性部位需要锌离子，能有效水解β-内酰MBLs主要包括5种类型:VIM、IMP、NDM、GIM和SPM，最常见的是NDM、IMP和VIM。目前为止NDM是流行最为典型的B类β-内酰胺酶类。

1.3.2外膜通透性降低

细胞膜的表面有许多的外膜蛋白聚集形成药物通道，针对特定的β-内酰胺类抗生素有特异性。当孔到道白缺失或表达降低时则会导致外膜通透性降低，导致药物无法通过细胞摸上的药物通道进入到细菌体内发挥药效，从而导致了细菌产生了耐药性。

1.3.3PBPs蛋白的改变

PBPs是合成细菌细胞必所必须的一种酶，碳青霉烯类药物，可与细胞内膜上的PBP靶点特异性结合，干扰细胞壁肽聚糖的合成，从而导致细菌溶解。当PBP发生改变，如亲合力降低、数量下降时，就导致了细菌对碳青霉烯类抗菌药物的耐药。目前已发现6种PBP，其中PBP2和PBP3与碳青霉烯类抗菌药物最具关联性。而且相关研究表明，编码PBP2的基因（mrdA）突变位置不同，可导致菌株耐药的碳青霉烯类抗菌药物不同。

1.3.4主动外排系统过表达

细菌外排泵系统的突变或高度表达可以提高泵出效率，导致细菌内部抗菌药物水平降低，从而产生细菌耐药。这种耐药机制特异性不高，可以针对多种结构抗菌药物。在肠杆菌科细菌中，以AcrABTolC外排泵系统最为常见，可介导细菌对多种抗菌药物，尤其是β-内酰胺类抗菌药物的耐药，被认为是不产碳青霉烯酶CRE中主要耐药机制。

2.材料与方法

2.1实验材料

2.2.1样品的采集

本研究中用于调查2023年山东省局部地区宠物源碳青霉烯耐药菌的流行分布特征的299份样品，均来源于2023年期间本实验室在山东省德州、济宁、青岛、聊城和泰安等地对多家宠物医院、社区居民伴侣动物以及宠物售卖场所采集的样品。样品分离到的耐药菌株及其他细菌均由本实验室保存。

2.1.2主要仪器、培养基与试剂的制备

（1）主要仪器：一次性培养皿，酒精灯，接种环，涂布棒，锥形瓶，1.5mL离心管，2mL离心管，2mL冻存管，PCR小管，水浴锅，微波炉，DNA凝胶电泳仪，高压蒸汽灭菌锅，凝胶成像仪，PCR仪，游标卡尺等。a

（2）培养基的制备：

①营养肉汤：称取7.6g营养肉汤溶于400mL的蒸馏水中，高压灭菌后备用。

②麦康凯固体培养基：称取20.8g麦康凯琼脂（MacConkey Agar)溶于400mL的蒸馏水中，高压灭菌后，使用微波炉融化高压灭菌后的培养基，放至不烫手时，加入156.25μL的β-内酰胺类药物（，混匀后分装在一次性培养皿中。

③Mueller-Hinton琼脂培养基：称取16.8g的Mueller-Hinton琼脂溶于400mL的蒸馏水中，高压灭菌后，使用微波炉加热融化后，分装在一次性培养皿中。

实验所用试剂：甘油，生理盐水，DEPC水，1×TAE，10×SYBR Green Master Mix,蒸馏水，β-内酰胺类药物（MEM），引物（blaNDM-F and blaNDM-R)。药敏片包括：丁胺卡那，复方新诺明，头孢西丁（美福仙），庆大霉素，氨曲南，氟苯尼考，头孢噻肟，头孢他啶，环丙沙星，四环素，亚胺培南。

2.2实验方法

2.2.1样品的采集

在无菌的采集管中加入15mL的已经高压灭菌好的营养肉汤，在山东省局部地区的多家宠物医院和小区对宠物进行肛拭子的采集。采集好的采集管放在4℃的冰箱中，低温保存。

2.2.2样品的分离与鉴定

将采集管放在恒温振荡培养箱中，培养12h，进行细菌的扩增。使用加入β-内酰胺类药物（MEM）的麦康凯培养基对样本进行分离与鉴定。称取7.6g麦康凯琼脂粉放在大锥形瓶中，加入400mL蒸馏水后混匀，用高压蒸汽灭菌锅对培养基进行高压灭菌。高压灭菌结束后，取出麦康凯培养基，用微波炉加热融化后，待放至不烫手的温度时加入156.25μL的β-内酰胺类药物（MEM），混匀。在超净台中，使用无菌的一次性培养皿对其进行分装。待培养基凝固后，进行平板划线。将接种环用酒精灯烧过以后，放凉后，蘸取菌液进行平板划线。然后将划好的培养皿放在37℃细菌恒温培养箱中过夜培养12h。

2.2.3耐药菌的扩增和冻存，DNA提取与PCR扩增

将灭菌好的营养肉汤溶液分装在2mLEP管中，在高压灭菌好的2mL的离心管中加入900μL肉汤，用白色枪头在培养好的培养皿中蘸取其中的单个菌落俩下，在分装好营养肉汤肉汤的吹打几次，丢掉枪头，在离心管上标记好菌株编号和所使用的抗生素，过夜培养12h。

耐药菌株的冻存：取扩增好的菌液600μL加400μL甘油，震荡均匀后，放在冻存盒中，放在-80℃冰箱中保存。

DNA的提取：将培养好的菌株取出80μL样品加入到1mL的营养肉汤溶液中，过夜培养12h。将离心管放在离心机中转速5000rpm，离心5min后倒掉上清液。随后加入100μL生理盐水，震荡均匀，将离心管放在-80℃冰箱中，10min后取出；接着用电磁炉隔水加热，煮沸10min；继续放在-80℃冰箱中冻10min，取出后放至到菌液溶解，用离心机12000rpm，离心10min，取上清液。

PCR扩增：

PCR反应体系和运行参数见表1所示：

表1 PCR反应体系

体系组分

体积（μL）

模板

2×MIX

12.5

DEPC水

9.5

blaNDM-R

blaNDM-F

PCR运行参数：（95℃，3min）＋｛（95℃，30s）＋（56℃，30s）＋（72℃，45s）｝×30＋（72℃，5min）

跑胶：使用1g的琼脂糖加入100mL的1×TAE，使用微波炉煮沸后，加入8μL的核酸染料，混匀后倒胶，在胶板中插入俩个25孔梳子。放至凝固后，轻轻提起梳子，放在电泳仪中，每排第一个孔，加入5μL DNA Marker，其他按顺序加入8μL PCR反应后的样品。结束后，用凝胶成像仪对跑好的胶进行观察，将图片命名保存好。

2.2.4药敏实验

超净台内操作）：将培养好的菌液，使用移液枪取200μL加入到配置好的Mueller-Hinton培养基中，用涂布器涂布均匀，使用后，将涂布器用酒精灯灼烧灭菌，晾凉后，随后继续涂布。在培养皿上标记好菌株名称和日期，将培养皿分四区贴上药敏片。全部完成后，将培养基倒扣在27℃培养箱中过夜培养12h，第二天用游标卡尺对数据进行测量，并记录下来。药敏片的抑菌圈参考数值如表2所示：

表2 药敏片的抑菌圈数值

抗生素

纸片含量（μg/mL）

抑菌环直径

耐药R

中介I

敏感S

丁胺卡那

≤14

15-16

≥17

复方新诺明SMZ/TMP

23.75/1.25

≤10

11-15

≥16

头孢西丁（美福仙）

≤14

15-17

≥18

庆大霉素

≤12

13-14

≥15

氨曲南

≤15

16-21

≥22

氟苯尼考

≤12

13-17

≥18

头孢噻肟

≤14

15-22

≥23

头孢他啶

≤14

15-17

≥18

环丙沙星

≤15

16-20

≥21

四环素

≤14

15-18

≥19

亚胺培南

≤13

14-15

≥16

3.结果

3.1分离鉴定的菌株和blaNDM阳性的菌株

在采集到的299株样本中分离纯化到42株菌株。经过PCR和跑胶后，blaNDM呈阳性的菌株33株，其中有25株来源于聊城，6株来源于泰安，1株来源于德州，一株来源于青岛。

3.2药敏数据以及敏感情况

对纯化筛选出来的菌株进行，用Mueller-Hinton培养基做药敏实验，筛选出含有耐药基因的菌株，观察数据情况，并对11种抗菌药物对blaNDM阳性菌株耐药情况进行统计，如表3所示。

表3 33株宠物源碳青霉烯耐药菌对11种抗菌药的耐药情况

药物名称

S 敏感率%

I 中等敏感率%

R 耐药率%

丁胺卡那

54.55%（18/33）

9.01%（3/33）

36.36%（12/33）

复方新诺明

24.24%（8/33）

0%（0/33）

75.76%（25/33)

头孢西丁（美福仙）

0%（0/33）

100%（33/33）

庆大霉素

0%（0/33）

100%（33/33）

氨曲南

36.36%（12/33）

33.33%（11/33）

30.30%（10/33）

氟苯尼考

6.06%（2/33）

3.03%（1/33）

90.91%（30/33）

头孢噻肟

0%（0/33）

100%（33/33）

头孢他啶

0%（0/33）

100%（33/33）

环丙沙星

6.06%（2/33）

15.15%（5/33）

78.79%（26/33）

四环素

0%（0/33）

3.03%（1/33）

96.97%（32/33)

亚胺培南

0%（0/33）

100%（33/33）

3.3数据统计分析

2023年山东省局部地区采集的299株样品总共分离到42株，分离率为14.05%；42株样品中有33株检测到blaNDM阳性，blaNDM阳性的检出率为11.04％；其中德州地区blaNDM阳性菌株在33株菌株中占比3.03％，济宁地区占比0％，青岛地区占比3.03％，聊城地区占比75.76％，泰安地区占比18.18％。由数据，可以了解到聊城筛选到的宠物源碳青霉烯耐药菌的占比最高。分离出的blaNDM阳性菌株的各地区占比情况。

4.讨论

4.12023年山东省局部地区碳青霉烯耐药菌流行率分析

本实验室调查了2023年从山东省局部地区的五个城市的多家宠物医院，社区伴侣宠物以及宠物贩卖场所采集的299份宠物粪便样品。通过分离纯化碳青霉烯耐药菌，提取耐药菌DNA后利用PCR技术筛选blaNDM基因的流行率，结果表明聊城市和泰安市的粪便样本中阳性率较高；德州市，济宁市和青岛市的粪便样本中检测到的阳性率比较低。

目前，碳青霉烯类抗生素是治疗耐药菌感染的“最后一道防线”，2009年中国的抗生素使用量高居世界第一，兽药占比60%，2014年兽药使用量达到历史最高峰，2018年使用量才开始下降，2020年，我国农业农村部门严禁在饲料中添加抗生素，减轻抗生素对动物源食品安全和公共卫生安全的危害。虽然碳青霉烯类药物也并未被允许使用在宠物行业，但逐渐上升的检出率表明在伴侣动物中关于碳青霉烯耐药菌的危害逐渐升高，宠物治疗在抗生素上的过度使用和滥用，对伴侣动物和人类的健康与安全带来了危险隐患。[3]

根据2023年对山东省局部地区多家宠物医院，社区伴侣宠物以及宠物贩卖场所的样品调查，发现聊城市样本检出率是最高的，其次是泰安市。blaNDM阳性基因检出率显示了宠物源碳青霉烯耐药菌对人类和伴侣宠物的健康卫生情况的隐患，建议今后减少宠物治疗对抗生素的过量使用。

4.2碳青霉烯耐药菌的分离情况

在对采集的299株样品的分离纯化中，成功分离出42株耐药菌，碳青霉烯耐药菌的分离率为14.05%，根据实验结果表明在德州市、济宁市、聊城市、青岛市和泰安市的宠物源样本中，泰安市的样本中宠物源碳青霉烯耐药菌分离率最高，高达55.56%，其次是聊城市，宠物源碳青霉烯耐药菌分离率为25.49%。（表4）对于不同种类宠物的粪便样本中，宠物犬碳青霉烯耐药菌分离率最高，高达：15.35%。（表5）

表4 各地区碳青霉烯耐药菌的分离情况

城市

样品数量

分离到的耐药菌株

分离率

德州

1.67%

济宁

1.67%

聊城

102

25.49%

青岛

3.39%

泰安

55.56%

表5 不同品种宠物碳青霉烯耐药菌的分离情况

宠物品种

样品数量

分离到的耐药菌株

分离率

犬

254

15.35%

猫

2.22%

4.3blaNDM阳性菌的检出率和地域分布特征

通过对分离出来的碳青霉烯耐药菌株的DNA提取和PCR检测，从最初分离出来的42株碳青霉烯耐药菌株中，得到33株blaNDM阳性的菌株，这表示blaNDM阳性菌株的检出率为11.04%。聊城分离到的blaNDM阳性菌株数量最高，而泰安市采集的样本中blaNDM阳性的检出率最高。其中德州分离到1株blaNDM阳性菌株，济宁分离到0株blaNDM阳性菌株，聊城分离到25株blaNDM阳性菌株，青岛分离到1株blaNDM阳性菌株，不同城市blaNDM阳性菌的检出率（表6），不同品种宠物blaNDM阳性菌的检出率（表7）以及blaNDM阳性菌地域分布特征（表8）

表6 不同城市blaNDM阳性菌的检出率

城市

样品数量

blaNDM阳性数

检出率

德州

1.67%

济宁

聊城

102

24.51%

青岛

1.69%

泰安

3.33%

表7 不同品种宠物blaNDM阳性菌的检出率

宠物品种

样品数量

blaNDM阳性数

检出率

犬

254

12.60%

猫

2.22%

表8 blaNDM阳性菌地域分布特征

城市

德州

济宁

聊城

青岛

泰安

blaNDM阳性地域分布占比

3.03%

75.76%

3.03%

18.18%

4.4blaNDM阳性菌株的药敏实验结果分析

通过对分离纯化出来的33株blaNDM阳性的菌株进行药敏实验，对其进行统计和分析。可以发现分离出来的2023年山东省部分地区的宠物源碳青霉烯耐药菌，对头孢西丁，头孢噻肟，头孢他啶，庆大霉素，四环素以及亚胺培南都具有很强的耐药性。[4]氟苯尼考和环丙沙星对blaNDM阳性菌株的抑制效果也并不强；只有丁胺卡那，氨曲南以及复方新诺明对blaNDM阳性菌株的抑制效果较好一些。

表9 blaNDM阳性菌株的药敏实验结果

药物名称

S 敏感

I 中等敏感

R 耐药

丁胺卡那

复方新诺明

头孢西丁（美福仙）

庆大霉素

氨曲南

氟苯尼考

头孢噻肟

头孢他啶

环丙沙星

四环素

亚胺培南

5.结论

（1）碳青霉烯耐药菌在五个城市中，在聊城市和泰安市的检出率和分离率比较高，有一定的传播风险。

（2）在对五个城市宠物源粪便样本的检测中，可以发现宠物猫携带blaNDM阳性菌株的概率是非常小的，而犬携带blaNDM阳性菌株的概率比较大，推测可能是犬的普遍饲养环境要相对较差一些。

（3）对于blaNDM阳性菌株的药敏实验，不难可以发现绝大多数的抗生素对于碳青霉烯耐药菌的抑制作用都不太强，同时这也说明了碳青霉烯耐药菌给人类和伴侣宠物的健康和安全带来了隐患

参考文献

王民歌. 我国东南沿海鸭场耐药基因的流行特征及blaNDM的传播机制研究[D]. 广东:华南农业大学,2021.马成雪,梁胜男,田赛,等.碳青霉烯类耐药肠杆菌的耐药传播机制及全球流行分布情况[J].中国消毒学杂志,2021,38(09):699-704.尹义. 活禽交易市场中碳青霉烯耐药基因blaNDM的流行分布和传播机制研究[D].扬州大学,2024.DOI:10.27441/d.cnki.gyzdu.2023.001812.杨润时. 动物源肠杆菌中碳青霉烯耐药基因blaNDM的流行分布及分子传播机制研究[D].华南农业大学,2022.DOI:10.27152/d.cnki.ghanu.2019.000310.