斑马鱼行为篇：铁对斑马鱼学习记忆能力影响
与其他模型动物相比斑马鱼具有胚胎和幼鱼透明便于观察、样本量大适合高通量的毒理学筛选、与人类基因组高度保守等优势而被广泛用于毒理学研究。斑马鱼胚胎体外受精体外发育且胚胎透明便于观察，非常适合于胚胎发育毒理学实验研究，已成为胚胎发育毒性研究的首选。且斑马鱼由于生活在水中，便于测试一些浓度较低的受试物对于机体的毒性影响。斑马鱼的饲养与繁殖条件相对常用的小鼠动物模型来说更加便捷。
野生型成年斑马鱼（AB品系），循环水（100L）中含有0.84gCaSO4、7.5gNaHCO3和1.8gNaCl，水的温度保持在28±1℃，pH值保持在7.5±0.5，水质总硬度62mg/L（以CaCO3计），电导率475±50μS。光照/黑暗处理分别为14h/10h。成年斑马鱼每天喂食两次丰年虾，早晚各一次；斑马鱼幼鱼5-15d喂食适量草履虫与少量磨碎的丰年虾，15d后喂食磨碎的丰年虾，30d后正常投喂。
斑马鱼铁处理模型的建立
FeCl3水中易发生水解，以铁离子的量表示浓度，配置为10g/L的母液备用，母液加浓盐酸进行酸化，减弱铁离子在水中的水解。使用前利用鱼房循环水稀释至实验所需的浓度100、300与600μg/L，调pH至5.8。选取6月龄健康的成鱼进行暴露试验。随机分为对照，100、300与600μg/L组，每组20条健康雄性成鱼，暴露时间为4周。
斑马鱼不同时间铁暴露
进行对照、300μg/L组的暴露试验，每个浓度分为4组，浸泡时间分别为1、2、3、4周，每组20条6月龄成年雄鱼。浸泡液每两天更换一次，期间斑马鱼正常喂食。
T迷宫结构图
实验所用的T迷宫主要由水平方向的T型浅水通道和左右两边的深水区组成，其中右边的深水区设置为营养富集区（Enriched chamber，EC），内部设置道具模拟自然生态环境，底部放有细砂石、人工绿植，水中加一烧杯，烧杯内部有若干条斑马鱼。开始实验前一天，将待测的斑马鱼分组次放置于T迷宫中，让其自由游动2h以适应T迷宫各区域环境，第二天上午开始T迷宫测试，将斑马鱼小心放入起始区，利用监测系统实时追踪，记录斑马鱼从起始点出发到完全进入EC区的时间（该段时间即为潜伏期），每条斑马鱼的测试总时间为6min（进入EC区标准：要求每条斑马鱼必须进入EC区且停留时间大于30s）。进入EC区的斑马鱼，皆在EC区喂食作为奖赏；而未进入EC区的斑马鱼，在测试完成后将其引入EC区，且停留3min，继而给予食物作为奖赏。测试后将每条斑马鱼但独饲养，并记录编号，测试期间只能在EC区喂食。总测试天数为5d，每天上午同一时间开始测试，记录其潜伏时间。
FeCl3对鱼卵的LC50确定
利用不同浓度的FeCl3溶液对AB鱼4hpf鱼卵进行浸泡处理，浸泡时间为4d，期间观察记录其死亡与孵化情况。
前期准备：实验前一天晚上将雌鱼与雄鱼各1条放入繁殖用鱼缸，中间加挡板使雌雄分开，并在鱼缸外蒙黑布（目的是方便控制鱼产卵时间），第二天早8:00揭开黑布并去除挡板，让其在光源刺激下开始追尾产卵。期间每1h观察是否产卵，当产卵后记录时间，并在产卵后4h内根据鱼卵数量将鱼卵进行分组，开始铁盐处理。
设定浓度分别为0、6、7、8、9、10mg/L，每个浓度组3个重复。铁盐处理后每天记录死亡情况，及时剔除死亡鱼卵。每天更换浸泡液体。浸泡时间为4d。 根据死亡情况计算LC50。经计算得知LC50=7.957mg/L(以Fe3+的量表示)。
斑马鱼鱼卵FeCl3暴露试验
鱼卵前期准备的过程与上述试验一致，在受精后4h将鱼胚胎随机分组，加入12孔板，每孔20粒健康的斑马鱼胚胎，每孔加入终浓度为0、1、2、4、6、8mg/L的FeCl3水溶液2mL。FeCl3暴露后每天记录死亡情况，及时剔除死亡胚胎，每天更换一次FeCl3溶液。实验重复3次。
斑马鱼24hpf的胚胎自主抽动次数的统计
斑马鱼胚胎发育至24hpf时尾部会出现自主抽动现象。利用倒置光学显微镜记录24hpf时各浓度组1min内抽动次数，每个浓度组选择8个胚胎进行统计。实验重复3次。
斑马鱼幼鱼运动行为测定
FeCl3暴露第5d后，每个浓度组随机选取8条斑马鱼幼鱼置于96孔板中，每孔1条，并进行编号。将96孔板放入Noldus动物行为视频采集系统观测平台，采用EthovisionXT10.0软件追踪采集视频，分析3min内幼鱼的运动路线图，并计算各组总移动距离和平均运动速度。实验重复3次。
参考文献：
1、斑马鱼阿尔茨海默病动物模型的建立[D]. 蒲韵竹.西南大学,2013
2、Changes and Significance of SYP and GAP-43 Expression in the Hippocampus of CIH Rats.[J]. Zhu Xiankun;;Wang Pei;;Liu Haijun;;Zhan Jing;;Wang Jin;;Li Mi;;Zeng Ling;;Xu Ping.International journal of medical sciences,2019
3、Ferroptosis, a Recent Defined Form of Critical Cell Death in Neurological Disorders.[J]. Wu Jia-Rui;;Tuo Qing-Zhang;;Lei Peng.Journal of molecular neuroscience : MN,2018
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