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斑马鱼行为篇：药源性眼损伤斑马鱼模型

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2024-08-18 17:39

有研究表明，长期使用含苯扎溴铵或羟苯乙酯的滴眼液对眼部有不同程度的损伤，导致眼部不适、过敏、纤维化、结膜鳞状化、角膜厚度变化以及炎症等症状。至今，有效的快速评价化合物致眼损伤的体内模型尚未见报道。近年来，斑马鱼凭借其繁殖周期短，使用药物量少、遗传水平与人类相似、个体小、胚胎透明、便于显微操作等优势，被广泛用于药物筛选和安全性评价的疾病模型。斑马鱼的视觉系统与包括人类在内的其他脊椎动物非常相似，例如其视网膜和晶状体的形态和结构，以及其在受精后第5天（dpf）后就具有视觉功能，因此斑马鱼眼睛可作为较好的视觉模型，受到视觉科学研究领域的广泛关注。本研究以苯扎溴铵和羟苯乙酯为探针药物，药源性斑马鱼眼损伤模型可评价这两类化合物类似物的眼毒性提供理论依据和评价参照标准，并为快速评价化合物的眼毒性提供体内模型。

斑马鱼野生型AB系，饲养温度为（28.5±1）℃，光照条件为14h光照/10h黑暗，饲养液的电导率为500~550μS/cm。斑马鱼幼体的获得：取野生型斑马鱼成鱼雌雄各两条交配，收集受精卵，清洗后，挑选表型正常的受精卵养殖在斑马鱼饲养液中，待发育至3dpf用于后续实验。

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LD5和LD50测定

随机选取发育正常的3dpf斑马鱼，每组各30条。给予不同浓度的苯扎溴铵（10、20、40、60、80、100和120μg/ml）和不同浓度的羟苯乙酯（50、100、200、400、600、800、1000和1200μg/ml），以0.1%DMSO为对照组。给药72h后，统计每组斑马鱼死亡情况，计算死亡率（%），用GraphPadPrism8.0统计学软件绘制“致死率-浓度”效应曲线，用Bliss法计算苯扎溴铵和羟苯乙酯对斑马鱼毒性的LD5和LD50值。

活体观察斑马鱼眼损伤

随机选取发育正常的3dpf斑马鱼，每组各20条，以0.1%DMSO为对照组，给药组置于不同浓度的苯扎溴铵（4和10μg/ml）和羟苯乙酯（10和50μg/ml）药液中，28.5℃培养72h，每24小时换液一次，在体式显微镜下观察斑马鱼幼鱼眼部形态变化并拍照记录。利用ImageJ软件测量虹膜带宽和瞳孔直径，并计算两者的比值。

行为学检测

取野生型斑马鱼3dpf幼鱼，以未处理组为对照，分别给予不同浓度的苯扎溴铵和羟苯乙酯，72h后，清洗3遍，置于96孔板中，每孔一条鱼，每组12条鱼，放入斑马鱼行为轨迹跟踪系统（斑马鱼行为检测仪）中静置10min，黑暗中5min后立即给予光刺激20s，每20s记录一次数据，以此循环重复3次，计算黑暗中第280~300秒的平均速度、光照20s的平均速度，以及对应的运动距离。并跟踪记录各处理组幼鱼在黑暗条件下最后20s（第280~300秒）和光照条件下20s的游泳轨迹。

苯扎溴铵和羟苯乙酯对斑马鱼幼鱼运动行为的影响

用斑马鱼行为检测仪测量发现对照组中幼鱼在黑暗和光照条件下平均速率和运动总距离无明显差异，而苯扎溴铵和羟苯乙酯处理组中的幼鱼在光照刺激下的平均速率和运动总距离显著性低于黑暗条件下的平均速度和运动总距离。同时，药物处理组幼鱼的平均速度和运动总距离与对照组相比，在黑暗条件下无明显差异，但在光照条件下运动速度和运动总距离呈剂量依赖性降低。运动轨迹图显示在黑暗条件下，药物处理组中个别斑马鱼的运动轨迹呈现轻度异常，多数未见明显异常，说明这两种化合物对斑马鱼的运动神经和肌组织无明显损伤；在突然的光照刺激条件下，与对照组相比，苯扎溴铵和羟苯乙酯处理组幼鱼呈不规则游动且运动速度和运动距离明显下降，说明给药组幼鱼对光刺激的调节能力降低，有可能是由于药物处理组的斑马鱼眼部虹膜损伤，产生畏光反应。

以斑马鱼为模式动物来研究视觉功能已成为热点，并建立了斑马鱼眼动反应（OKR）行为模型，该模型主要应用于视觉信息处理、神经环路、视觉系统发育以及药物毒理等方面的研究。然而，该模型的使用范围较窄，并且操作繁琐，不适用于大规模的药物筛选和评价。以苯扎溴铵和羟苯乙酯为探针药物，建立一种快速筛选和评价化合物眼毒性的斑马鱼模型和方法。通过活体表型显微观察，发现苯扎溴铵和羟苯乙酯能导致斑马鱼幼鱼眼部虹膜损伤、角膜斑块样病变以及巩膜凸起样病变，这些表型特征与人类的某些眼疾病症相似。因此，活体观察斑马鱼幼体眼部表型可以作为一种简单、快速、高效的初步评价眼损伤的检测方法。

苯扎溴铵和羟苯乙酯对斑马鱼行为学的影响

A：苯扎溴铵和羟苯乙酯对幼鱼在5min黑暗刺激的最后20s和光刺激20s平均速度的统计结果；B：苯扎溴铵和羟苯乙酯对幼鱼在5min黑暗刺激的最后20s和光刺激20s运动总距离的统计结果；苯扎溴铵和羟苯乙酯对幼鱼在黑暗刺激最后20s（C）和光刺激20s（D）的运动轨迹的影响。

参考文献：

The optokinetic response in zebrafish and its applications.[J]. Huang Ying-Yu;;Neuhauss Stephan C F.Frontiers in bioscience : a journal and virtual library,2008

张苗青,胡昌勤,张靖溥.药源性眼损伤快速评价的斑马鱼模型[J].中国医药生物技术,2021,16(02):97-104.

Zebrafish models of human eye and inner ear diseases.[J]. Blanco-Sánchez B;;Clément A;;Phillips J B;;Westerfield M.Methods in cell biology,2017

Molecular description of eye defects in the zebrafish Pax6b mutant, sunrise, reveals a Pax6b-dependent genetic network in the developing anterior chamber.[J]. Takamiya Masanari;;Weger Benjamin D;;Schindler Simone;;Beil Tanja;;Yang Lixin;;Armant Olivier;;Ferg Marco;;Schlunck Günther;;Reinhard Thomas;;Dickmeis Thomas;;Rastegar Sepand;;Strähle Uwe.PloS one,2015

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