一种龟甲胶原多肽的提取方法与流程
本发明属于生物分离与纯化技术领域，尤其涉及一种龟甲胶原多肽的提取方法。
背景技术：
龟甲为龟科动物的背甲及腹甲，富含龟甲胶(胶原蛋白)、氨基酸、脂肪酸、矿物质、多酚类及甾体类物质等多种有效活性成分，具有滋阴潜阳、益肾强骨、养心补血的功效，《神农本草经》将其列为上品，常用于治疗阴虚潮热、骨蒸盗汗、头晕目眩、筋骨痿软、心虚健忘等症状。
龟甲胶由龟甲熬制而成，是驰名中外的滋补药品，有极好的滋阴、止血、养血之功效。而龟甲胶原多肽则是由龟甲胶进一步水解制得，比较而言，其分子量更小，具有更好的消化吸收特性及更有效的降血压、降胆固醇、免疫调节、抗氧化、抗衰老等生理功能。随着人们对天然营养健康食品需求的增加，龟甲胶原多肽以其良好的生物活性和稳定性越来越受到市场的青睐。
目前制备胶原多肽的方法主要有酸法、碱法、热解法和酶解法四大类，其中酸法提取能较好地保持胶原多肽的结构完整性，但品质不高；碱法提取易造成胶原多肽的三螺旋结构解体，且对设备材质要求较高；热解法虽操作简单，但水解时间较长，往往需要带压操作；酶解法成本偏高，产品具有较大的苦腥味，同时色泽暗黄、溶解性不好。
技术实现要素：
针对现有技术存在的问题，本发明的目的是提供一种利用微生物发酵法提取龟甲胶原多肽的方法，不仅操作简单、成本低廉，还能利用微生物的复杂生化过程达到一定的脱苦脱腥效果。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种龟甲胶原多肽的提取方法，包括以下步骤：
(1)预处理：取龟甲清洗干净，进行蒸煮脱脂处理，干燥，粉碎，得到龟甲粉；所述蒸煮脱脂处理包括将龟甲置于水中进行蒸煮或将龟甲在隔水的情况下进行蒸煮；
(2)发酵：按料液质量比为1:25-1:30的比例向步骤(1)制得的龟甲粉中加水配成龟甲粉溶液，然后添加2.0％-3.0％的葡萄糖，调节溶液的ph，再接种2.5％-3.5％的复合菌进行发酵培养；发酵完成后进行灭菌处理，得到发酵液；
(3)离心：将步骤(2)制得的发酵液进行离心处理，取上清液即为龟甲胶原多肽粗提液；
(4)干燥：对步骤(3)得到的龟甲胶原多肽粗提液进行真空冷冻干燥，得到龟甲胶原多肽制品。
优选地，所述步骤(1)中，蒸煮脱脂处理的温度为110-130℃，压力为0.1-0.3mpa，时间为30-50min。
优选地，所述步骤(1)中，干燥的温度为60-80℃，时间为50-70min。
优选地，所述步骤(2)中，ph调节为6.0-7.0。
优选地，所述步骤(1)中，粉碎后过100目筛。
优选地，所述步骤(2)中，所述复合菌为枯草芽孢杆菌和保加利亚乳杆菌按质量比为1-5:1-5复配得到。
进一步优选地，所述步骤(2)中，所述复合菌为枯草芽孢杆菌和保加利亚乳杆菌按质量比为1:1复配得到。
优选地，所述步骤(2)中，发酵培养方式为：在35-45℃，130-140r/min的条件下摇床培养45-50h。
优选地，所述步骤(2)中，灭菌处理的温度为110-130℃，时间20-40min。
优选地，所述步骤(3)中，离心处理的时间为5-15min，转速为4000-6000r/min。
优选地，所述步骤(4)中真空冷冻干燥的温度为55-65℃，时间为4-6小时，真空度为93.3-98.6kpa。
本发明的有益效果：
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
(1)本发明对粉碎前的龟甲在高温高压下进行蒸煮脱脂处理，不仅脱脂率高，减小了后续超微粉碎的压力，还能有效增强龟甲胶原蛋白与水分子的相互作用，提高蛋白的溶出率；
(2)采用复合菌(枯草芽孢杆菌和保加利亚乳杆菌的复合物)发酵，可以明显改善多肽的品质和口感，其中枯草芽孢杆菌能产多种蛋白酶且活性较强，大大提高了龟甲胶原多肽的产率；保加利亚乳杆菌作用于蔗糖产乳酸，使产物具有特殊香味，其苦味肽含量极低，多肽含量丰富且溶解性高，易被人体消化。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细的说明。
实施例1
一种龟甲胶原多肽的提取方法，包括以下步骤：
(1)预处理：取龟甲清洗干净，在温度为121℃，压力为0.2mpa下进行蒸煮脱脂处理40min，然后置于温度为70℃的干燥箱内干燥1h，而后经粉碎机粉碎后过100目筛，得到龟甲粉；
(2)发酵：按料液质量比为1:25的比例向步骤(1)制得的龟甲粉中加水配成龟甲粉溶液，然后添加2.0％的葡萄糖，调节溶液的ph为6.0，再接种2.5％的复合菌(枯草芽孢杆菌：保加利亚乳杆菌＝1:1)，并在40℃、140r/min条件下摇床培养48h；完成后于121℃下灭菌30min，得到发酵液；
(3)离心：将步骤(2)制得的发酵液在5000r/min的转速下离心处理10min，取上清液即为龟甲胶原多肽粗提液；
(4)干燥：对步骤(3)得到的龟甲胶原多肽粗提液进行真空冷冻干燥(温度为60℃，真空度为95kpa，时间为5小时)，得到龟甲胶原多肽制品。
实施例2
一种龟甲胶原多肽的提取方法，包括以下步骤：
(1)预处理：取龟甲清洗干净，在温度为121℃，压力为0.2mpa下进行蒸煮脱脂处理40min，然后置于温度为70℃的干燥箱内干燥1h，而后经粉碎机粉碎后过100目筛，得到龟甲粉；
(2)发酵：按料液质量比为1:28的比例向步骤(1)制得的龟甲粉中加水配成龟甲粉溶液，然后添加2.5％的葡萄糖，调节溶液的ph为6.5，再接种3.0％的复合菌(枯草芽孢杆菌：保加利亚乳杆菌＝1:1)，并在40℃、140r/min条件下摇床培养48h；完成后于121℃下灭菌30min，得到发酵液；
(3)离心：将步骤(2)制得的发酵液在5000r/min的转速下离心处理10min，取上清液即为龟甲胶原多肽粗提液；
(4)干燥：对步骤(3)得到的龟甲胶原多肽粗提液进行真空冷冻干燥(温度为60℃，真空度为95kpa，时间为5小时)，得到龟甲胶原多肽制品。
实施例3
一种龟甲胶原多肽的提取方法，包括以下步骤：
(1)预处理：取龟甲清洗干净，在温度为121℃，压力为0.2mpa下进行蒸煮脱脂处理40min，然后置于温度为70℃的干燥箱内干燥1h，而后经粉碎机粉碎后过100目筛，得到龟甲粉；
(2)发酵：按料液质量比为1:30的比例向步骤(1)制得的龟甲粉中加水配成龟甲粉溶液，然后添加3.0％的葡萄糖，调节溶液的ph为7.0，再接种3.5％的复合菌(枯草芽孢杆菌：保加利亚乳杆菌＝1:1)，并在40℃、140r/min条件下摇床培养48h；完成后于121℃下灭菌30min，得到发酵液；
(3)离心：将步骤(2)制得的发酵液在5000r/min的转速下离心处理10min，取上清液即为龟甲胶原多肽粗提液；
(4)干燥：对步骤(3)得到的龟甲胶原多肽粗提液进行真空冷冻干燥(温度为60℃，真空度为95kpa，时间为5小时)，得到龟甲胶原多肽制品。
对比例1
一种龟甲胶原多肽的提取方法，包括以下步骤：
(1)将10kg龟甲洗净，破碎至细度小于2×2mm，然后投入50l的水中浸泡2小时；
(2)向上述浸泡有龟甲的水中缓慢加入木瓜蛋白酶(80万u/g)2.5kg和菠萝蛋白酶(80万u/g)2.5kg，边加边搅拌混匀，然后调节ph至6.5，升温至45℃，保温4小时；
(3)加热至100℃使酶灭活，然后趁热过滤，得到滤液，即为酶解龟甲胶原蛋白肽；
实施例1-3及对比例1的性能测试数据如表1所示：
表1实施例1-3及对比例1的性能测试结果
从以上结果可以看出，与现有技术的酶法提取相比，采用本发明的提取方法可以明显提高龟甲胶原多肽的得率，有效改善多肽制品的口感。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，本领域的技术人员在本发明的技术构思范围内进行的多种等同替代或简单变型方式，均属于本发明的保护范围。
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