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【神麻人智】非人类灵长类动物模型在儿科麻醉神经毒性研究中的应用

萌宠菠菠乐园
2024-09-14 12:14

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许多动物模型已被用于研究暴露于临床相关浓度的全身麻醉剂的短期或长期的发育性神经毒性。使用非人类灵长类动物 (Nonhuman Primate，NHP) 的儿科麻醉模型可能更准确地反映人类状况，因为它们在生殖、发育、神经解剖学和认知方面与人类的系统发育相似。虽然不像其他动物模型那样应用广泛，但 NHP 模型在麻醉诱导的发育性神经毒性研究中的贡献是必不可少的。在这篇综述中，我们讨论了如何使用新生NHP 动物来模拟儿科麻醉剂暴露；NHP 如何解决关键数据空白以及 NHP 模型在全身麻醉诱导的发育性神经毒性研究中的应用。NHP模型在全身麻醉诱导的发育性神经毒性研究中的适当应用和评估在提高对与儿科全身麻醉药相关的潜在神经毒性的理解和认识方面发挥了关键作用。

全身麻醉剂 (General anesthetics，GA) 主要通过抑制兴奋性或增强抑制性突触传递对患者产生影响。在过去的3年中，经大量大鼠、小鼠和非人灵长类动物 (NHP) 的研究证实，在大脑发育井喷期，长期暴露于临床相关浓度的常用全身麻醉会在不成熟的大脑中诱发神经毒性。动物实验中发育性神经毒性的证据引起了公众对小儿全身麻醉安全的担忧。美国食品药品监督管理局 (Food and drug administration，FDA) 发布公告 (www.fda.gov/Drugs/DrugSafety/ucm532356.htm)，警告因手术或治疗程序，用于3岁以下儿童或妊娠晚期的孕妇的长期（即 > 3 小时）或多次全身麻醉剂 (GA)暴露可能对大脑发育造成不利影响。同时，对于儿童进行的回顾性和前瞻性研究表明，对 3 岁以下的儿童进行一次短暂的全身麻醉不太可能增加以后生活中不良神经发育结果的发生率。

随着麻醉支持和术中监测技术的发展，现在更多的手术干预手段可用于儿科患者，甚至宫内胎儿。然而，这些都是在不同的麻醉或镇静方案下完成的，导致发育中的大脑更频繁和可能时间更久的暴露于GAs。此外，一些有生命危险的儿科患者在出生后的前3年接受复杂的手术治疗和长时间的麻醉。NHP模型在描述一些最脆弱的患者生命早期麻醉相关的风险方面发挥了关键作用。

由于物种和动物暴露环境的差异，从动物实验中获得的GA诱导的发育性神经毒性结果不能完全预测对人类患者的影响。然而，由于儿科临床研究的伦理考虑，使用动物模型来研究GA诱导的发育性神经毒性是不可替代的。尽管将动物研究中获得的GA诱导的神经毒性转化为儿科全身麻醉管理的深入认识存在障碍，但动物模型仍然是探索GA诱导的人类神经发育不良影响的有效工具。

用于检测全身麻醉剂 GA对神经发育的神经毒性作用的动物模型是多种多样的，包括但不限于线虫(秀丽隐杆线虫)、斑马鱼、啮齿动物、NHP等。尽管在报道的研究中使用了各种动物模型，但动物暴露于麻醉药时的年龄被严格定义为与大脑发育的关键时期相一致，最常见的是突触发生时期。这是大脑发育的一个关键阶段，此时突触形成旺盛，神经细胞对神经毒素敏感。在新生大鼠的研究中，GA诱导的脑皮质和丘脑核的神经元细胞死亡数量在出生后第3天(postnatal day，PNDs)到第14天(PNDs)与对照组相比显著增加，其中PND第7天凋亡神经元数量增加最多。这表明GA诱导的凋亡神经退行性变的严重程度可能与突触发生的速度有关。尽管啮齿类动物模型广泛用于临床前麻醉研究，但由于麻醉性能、监测身体稳健性和生物液收集(如血液和脑脊液[cerebral spinal fluid，CSF])等，实际上将大鼠用于儿童麻醉研究是存在问题的。

在恒河猴中，突触发生的高峰发生在妊娠(gestational day，GD) 第122天至出生后第5天, 出生后第35天大大降低。在用于确定GA和其他药物或物质(如哌甲酯、尼古丁、可卡因、大麻等)的神经毒性潜能的动物模型中，NHP模型被认为更具有预测性，因为它与人类在遗传学、生殖、发育、神经解剖组织和认知能力方面具有相似性。在GA研究中，NHP模型的具体优势包括麻醉程序容易管理，监测暴露期间的身体健康状况，以及可(重复)采集血液和/或脑脊液样本。没有其他常用的动物模型具有可与人类相比的功能性胎儿胎盘单位、单胎倾向和胎母体重比。在接下来的章节中，我们将讨论使用NHP模型研究GA诱导的神经毒性，包括GA暴露的设置、暴露期间的动物监测以及发育性神经毒性指标。

麻醉深度

全身麻醉剂以剂量依赖性的方式对中枢神经系统及其他身体系统产生影响。在模拟全身麻醉的实验麻醉过程中， GA的最佳剂量是至关重要的，以产生足够的镇痛，而不打乱受试者的生理状态。在麻醉诱导的发育性神经毒性的动物研究中，在达到一定的麻醉深度后（动物对物理刺激缺乏自主运动），通过吸入或静脉麻醉药稳定地维持，以防止动物用药过量。除了测试动物对物理刺激的缩爪反应，在NHP模型中测试了更多的物理刺激反应，包括存在眼睑反射、心率增加或爪子按压时血压的变化。这些研究表明，在新生NHP模型中，麻醉平面的准确滴定和维持(心率和血压的实时监测)是可以保证的。在预测这些药物/操作对人类造成的风险时，使用正确的麻醉水平来评估麻醉引起的神经损伤是至关重要的。

生理状态的监测和维持

循环和呼吸抑制是使用吸入或静脉麻醉药物的全身麻醉常见的可预测的不良反应。麻醉小动物模型需要监测其生命体征，维持其正常生理状态。在麻醉诱导的发育性神经毒性动物模型中，已经指定了一系列的措施来集中监测生理参数，包括生命体征、血氧水平和内稳态，以评估麻醉暴露期间是否发生任何变化，包括缺氧或低血压。

全身麻醉剂诱导的神经毒性取决于暴露时间

许多使用体外或体内模型的临床前研究表明，GAs (N -甲基-d -天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)型受体拮抗剂(如氯胺酮和氧化亚氮[N2O])或γ -氨基丁酸(gamma-amino-butyric acid，GABA)受体激动剂(如七氟烷和异丙酚)以剂量或暴露时间依赖的方式诱导神经元细胞死亡。

小儿麻醉引起的神经毒性与发育年龄有关

发育中的哺乳动物暴露NMDA受体激动剂或拮抗剂会扰乱内源性NMDA受体系统，导致神经元细胞死亡增加。早期生命阶段/生长突增是一个突触重塑和髓鞘形成强烈的时期。有假说认为，突触发生过程中过度抑制和/或刺激神经元活动会激活一个内部信号，使发育中的神经元进入程序性细胞死亡。

NHP 模型中的儿科麻醉诱导行为缺陷

临床前研究表明，在早期生命中，长时间或反复暴露于GA可诱导大脑皮层和皮层下结构中急性广泛的凋亡神经变性，导致包括记忆和学习功能的延迟、持久的行为障碍。除了海马依赖的记忆和学习功能，心理过程的其他组成部分，包括动机和抑制，序列学习和计数，基于连接前额皮质和纹状体的电路，已经在新生儿麻醉动物模型中进行了评估。由于NHP与人类在行为复杂性和心理能力上的相似性， GA诱导的认知障碍的NHP模型对麻醉诱导的发育性神经毒性的转化研究很有价值。

应用微创和可转化方法检测 NHP 模型中麻醉诱导的神经元死亡

大量研究表明，在妊娠后期和婴儿期长期暴露于麻醉与神经元损伤(包括神经凋亡)和神经认知损伤的风险增加相关。

与啮齿类动物相比，在模拟和理解发育中的灵长类动物大脑中的失调/疾病发病机制的分子机制方面，有许多相似之处，也有一些非常重要的差异。因为人类和NHPs的大脑生长突增比啮齿类动物的时间更长，所以将人类和NHPs的发育事件的时间相匹配比将灵长类动物和啮齿类动物的相同时间相关联问题要小得多。一般认为，与啮齿动物相比，NHP胎儿和人类胎儿在出生时的成熟程度更为相似。研究还表明，灵长类动物(如新生儿或PND为5/6的猴子)神经元活动定量成像的起始年龄远早于啮齿类动物(如PND为21的大鼠)。因此，应用NHP模型通过分子成像技术识别麻醉诱导的发育性神经毒性已被反复报道。

NHP模型中的遗传(DNA微阵列)和脂质谱分析(识别生物标志物)

NHP，例如恒河猴，93%的基因与人类相似，在许多情况下，可以更准确地预测人类的病理状况如何出现，灵长类动物的大脑对毒物/化学物质的脆弱性与大脑发育的成熟度密切相关。

为了剖析与麻醉剂（例如七氟醚）诱导的神经毒性相关的潜在机制，在 NHP 模型中使用 DNA 微阵列技术来检查、分析和解释来自特定兴趣区 (regions of interest，ROI) 的脑组织(如额叶皮层)的基因-环境相互作用和/或基因表达谱。

麻醉诱导神经毒性的体外测量

为了检测麻醉药物诱导的神经毒性，国家毒理学研究中心（National Center for Toxicological Research，NCTR）儿童麻醉研究团队最初使用PND 3猴子的脑组织(额叶皮层)建立了原代细胞培养系统。结果表明，添加 10-µM 氯胺酮在6小时后约有58%的失去活性，在24小时后约有75%的失去活性。这些实验还表明，在猴子额叶皮层培养物中，氯胺酮诱导的神经元细胞死亡在本质上似乎是凋亡和坏死的。氯胺酮可使NMDA受体NR1亚基表达明显增加。NR1 反义寡核苷酸的共同给药特异性地阻止 NMDA 受体 NR1 蛋白的合成，并随后阻断氯胺酮诱导的神经元损失。

NHP 相关研究的局限性和未来方向

局限性

大多数神经毒性的临床前研究依赖于动物，包括NHP模型。虽然NHP模型在基因、生理和行为方面是最接近人类的动物模型，但NHP模型也有其局限性。考虑到转化研究的复杂性，以及任何动物模型都不能完全复制人体的生理条件，例如人体和非生物活性物质之间的重要药代动力学差异，将 NHP 用于转化时存在许多挑战和机遇。同时，NHPs与啮齿动物等其他模型的使用因NHPs 的许多类人特征而变得复杂，导致研究人员、利益相关者和公众对其用于研究的问题提出质疑。

人们怀疑婴儿长时间接触常用的麻醉剂/镇痛剂可能会导致认知发育受损。然而，尚不确定神经发育缺陷是由全身麻醉引起的还是由需要使用全身麻醉的外科手术/基础疾病引起的。越来越多的人意识到，遗传或其他因素（例如个体恒河猴或食蟹猴的社会互动）的变化会影响实验结果。此外，比较/实施多种药物/给药方案或高通量方法是不切实际的(缓慢且昂贵)，在基于NHP的研究中，存在每只动物相关的费用以及获得足够数量的雌性、新生儿或幼崽的潜在困难。

未来的发展方向

研究麻醉/镇痛诱导的人类神经损伤的临界剂量-反应和时间-过程数据是很困难的。随着能够更好地研究特定机制，以及应用不易在体内发生的新兴技术的机会，体外模型已经被使用，可以克服限制并提供额外的数据。特别是，来自NHPs的神经干细胞(NSC)模型具有重现最关键的发育过程(包括增殖和分化)的能力，可以作为评估麻醉相关神经毒性的有效替代方案。为了开发新的和改进的测试方法，可以更好地预测人类对药物和/或环境化学品的反应，建议非人类 NHP NSC 培养系统可以促进机械研究，包括在动物模型中难以进行的麻醉神经毒性(例如，新生儿猴的可获得性有限)，但对于了解和预防围产期麻醉剂暴露的破坏性影响变得越来越必要。

麻醉研究领域的另一个重要/关键和一致的元素是进行临床前研究，使用临床相关剂量的麻醉剂，例如氯胺酮，在新生动物存在手术压力的情况下模拟临床情况。支持手术与随后生理变化之间相关性的数据已经积累，但神经发育缺陷是否直接由全身麻醉引起仍不确定。由于很难将麻醉本身的影响与手术的影响或需要手术的既往病理因素分开，因此有必要继续对新生儿NHPs进行研究，以获得关于麻醉(如氯胺酮)和/或氯胺酮诱导的神经退行性变的潜在神经保护作用的有价值的信息。重要的是，NHPs与人类的大小和生理相似性为验证这一理论提供了机会。

总结

一般来说，作为一个补充系统，当与生化、病理学、药代动力学、行为学、遗传和分子成像方法相结合时，NHP 可以成为研究与麻醉剂暴露相关的副作用的有效的、以机制为中心的工具。它在阐明与啮齿动物研究或大多数临床试验中不可能发生的早期生命麻醉相关的风险方面发挥了至关重要的作用。此外，正在进行的开发中的NHP的研究也可能有助于早期检测麻醉诱导神经毒性的生物标志物识别，并提供一个弥合临床前和临床研究之间差距的系统。如果是这样，NHP将有助于描述和减少与围产期麻醉相关的风险。

编译：吴桐

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