眼刺激性评价体外替代方法研究进展
眼刺激性评价体外替代方法研究进展
来源
中国新药杂志 2020 年 第 29 卷 第 6 期
作者
钱仪敏，王若男，李华，马璟
中国医药工业研究总院国家上海新药安全评价研究中心
上海益诺思生物技术股份有限公司
摘要
眼用药物及可能接触眼睛的受试物均应考虑进行眼刺激试验。Draize 试验一直是公认的测定急性眼刺激性的国际标准，但随着“3Ｒ”原则的实施，体外替代方法逐渐成为眼刺激性评价研究的发展方向。
目前已有多种体外替代方法得到了欧洲化学品局( European Chemical Agency，ECHA) 、美国国家环境保护局( US Environmental Protection Agency，US EPA) 及经济合作与发展组织( The Organization for Economic Cooperationand Development，OECD) 的认可，其中有5 种替代试验得到了OECD 的认可，分别是牛角膜不透明度和渗透性试验，离体鸡眼试验、短时暴露试验、重组人角膜上皮模型试验试验以及荧光素渗漏试验。
在使用体外替代方法时，由于单一的方法不能蕴含所有的观察终点，所以应根据每种替代方法的特点及应用范围进行组合以覆盖整个分层测试策略。相信随着体外替代试验研究的不断深入，有希望在未来能够完全替代体内试验。本文就眼刺激评价的体外替代方法和评价标准进行了综述。
关键词
吸入制剂；给药；人体；药代动力学研究；培训；一致性
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正文
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Draize 试验一直是测定急性眼刺激性的“金标准”。随着“3Ｒ”原则的实施，Draize 试验在伦理上及科学上均受到质疑，对动物造成极大的痛苦，且试验数据存在主观性，无法直接外推到人。
因此在过去的30 年中，科学家们一直在寻找Draize 试验的替代方法，先后提出了30 多种方法作为独立替代试验或测试策略的一部分，其中少数方法通过了欧洲替代方法验证中心( European Center for Validation of AlternativeMethods，ECVAM) 、机构间替代方法验证协调委员会( The Interagency Coordinating Committee onthe Validation of Alternative Methods，ICCVAM) 等专业机构的验证或被经济合作与发展组织( the Organizationfor Economic Co-operation and Development，OECD) 等监管机构所接受。
本文就眼刺激评价的体外替代方法和评价标准进行综述，为化学品的眼刺激性的早期筛选提供参考。
1
眼部用药毒性靶点
眼部药源性病变的靶点包括角膜、视网膜、视神经和视束、结膜［1］。人角膜是一种透明、无血管的组织，主要由人角膜上皮细胞、人角膜基质细胞和人角膜内皮细胞组成，起到维持眼压和调节视路的作用［2］。其中角膜上皮细胞连接紧密，是眼部三大屏障之一，能够维持角膜脱水状态并防止病原体进入基质，大部分屈光力发生在空气和泪膜的连接处。
目前已上市眼部用药以局部用药为主，角膜作为最先与药物接触的组织更易受到损伤，临床上药源性角膜病的发生率为22%，表现为过敏性角膜炎、角膜穿孔、角膜溃疡、角膜上皮脱落、角膜基质水肿等［3］。
视网膜是一层透明的膜，位于脉络膜内侧，由色素上皮层和视网膜感觉层组成。色素上皮层由色素上皮细胞组成，能够促进光感受细胞的修复与再生［4］。玻璃体腔内注射给药以及全身给药会造成视网膜毒性，临床上药源性视网膜病的发生率为16． 7%，表现为视网膜动脉阻塞、视网膜静脉阻塞、黄斑囊样水肿、视网膜脉络膜炎、睫状动脉阻塞［3］。
视神经是视路的开始，是中枢神经系统的一部分; 视束是视神经纤维经视交叉后位置重新排列的一段神经束。局部用药少有视神经病变的病例报道，大多数药物为全身性不良反应合并对视神经的损伤，如抗生素( 利奈唑胺) 、抗肿瘤药物( 长春新碱、苯丁酸氮芥) 、心律失常药物( 胺碘酮) 、中药( 川乌、草乌、保赤万应散) ［5］。临床上药源性的视神经病变发生率为11． 87%，表现为球后视神经炎、视神经炎、视神经萎缩［3］。
结膜是一层薄的半透明黏膜，由睑结膜、球结膜和穹隆结膜组成。分子量较大或全身给药不良反应严重的药物，可采用结膜下注射给药的方式提高房水内药物的浓度，注射后有眼部疼痛、结膜水肿的不良反应发生［6］。临床上药源性结膜病发生率为16. 95%，表现为过敏性结膜炎、结膜水肿、充血以及结膜坏死［3］。
2
严重眼损伤和眼刺激性的体外综合测试评估方法
全球化学品统一分类和标签制度( united nationsglobally harmonized system of classification andlabelling of chemicals，UN GHS) 将眼科药物及可能接触眼睛的化学品分为2 类，UN GHS 第1 类( UN，2017) 是指用于眼表后造成严重的眼组织损伤或视力衰退，且21 d 内不完全可逆的化学品; UN GHS 第2 类( UN， 2017) 是指用于眼表后引起眼部及其周围黏膜炎性变化，且21 d 内完全可逆的化学品，UN GHS第2 类( UN， 2017) 又进一步细分为“2A 类”( 炎性变化7 d 内可逆) 和“2B 类”( 炎性变化7 d 内不可逆) ;其余化学品为UN GHS 未分类物质［7］。
首先是通过对现有数据信息进行综合分析，包括化学品的理化性质( pH、酸碱度) 、现有的能够引起人产生严重眼损伤和眼刺激性化学品的试验数据、能引起皮肤腐蚀的化学品的数据、化学品的( 定量) 构效关系分析等。若通过综合数据信息的证据权重分析不能确定化学品的分类，则进行一些体外眼刺激替代试验来进一步考察化学品的刺激性。ECVAM 建议体外眼刺激试验方案采用2 种分层测试方法［8］: “自下而上”的方法，即当判断受试物无潜在眼刺激性时，首先使用能够准确可靠地鉴定出UN GHS 未分类物质的替代试验。
若实验结果表明该受试物属于UN GHS 未分类化学品，则无需进行进一步的试验验证; 而若实验结果表明该受试物具有严重眼损伤或眼刺激性，则需要用适当的可靠性高的替代试验，以进一步确认受试物属于UN GHS第1 类还是UN GHS 第2 类化学品。
“自上而下”的方法，即当判断受试物可能有严重的眼损伤或眼刺激性时，首先使用能够准确识别引起严重眼损伤受试物的替代方法。若实验结果表明该受试物属于UN GHS 第1 类化学品，则无需进行进一步的试验验证; 而若实验结果表明该受试物无严重眼刺激，则需要用其他适当的替代试验来进一步确认受试物属于UN GHS 未分类化学品还是UN GHS 第2 类化学品。而只有通过上述步骤仍不能确定分类的化学品，才最终考虑进行体内动物眼刺激试验，见图1。
3
眼刺激试验的替代方法
3． 1． 1 牛角膜浑浊和渗透性试验( bovine cornealopacity and permeability，BCOP) ［9］
BCOP 法属于离体器官试验，利用新鲜分离的牛角膜，将受试物直接加到角膜上皮的表面。通过定量检测角膜浑浊度及渗透性改变，计算体外刺激性评分( in vivo irritancyscore，IVIS) 对受试物进行分类。BCOP 法可用于辨别UN GHS 第1 类物质和UN GHS 未分类物质，可作为“自上而下”方法的初始替代试验，但其假阳性率较高，不应作为“自下而上”方法中替代试验的第一选择，且不建议用于对UN GHS 第2 类化学品的鉴定，见表1。
3． 1． 2 离体鸡眼试验( isolated chicken eye，ICE) ［10］
ICE 属于离体器官试验，利用短期体外培养的鸡眼球，将受试物暴露于角膜表面。通过定量检测角膜厚度、角膜浑浊度、荧光素滞留情况及肉眼观察形态学的改变来评价角膜上皮的损伤程度，还能够通过鸡眼球的组织病理学结果来评价角膜损伤的深度并预测损伤的可逆性，有助于提高判断结果的准确度。ICE 法可用于识别UN GHS 第1 类物质和UN GHS未分类物质，可作为分层测试策略中的初始替代试验，但ICE 不建议用于对UN GHS 第2 类化学品的鉴定，见表2。
3． 1． 3 短时暴露试验( short time exposure，STE) ［11］
STE 利用单层兔眼角膜细胞( single layer of rabbit corneal cells，SIＲC) ，将2 种浓度( 5% 及0． 05%) 的受试物溶解或混匀在0． 9% 生理盐水中，SIＲC 暴露于受试物5 min 后，用MTT 法测定细胞存活率从而对受试物进行识别。STE 法可用于识别UN GHS 第1 类物质和UN GHS 未分类物质，可作为分层测试策略中的初始替代试验，但ICE 不建议用于对UNGHS 第2 类化学品的鉴定，见表3。
3． 1． 4 重组人角膜上皮模型试验( reconstructed humancornea-like epithelium，ＲhCE) ［12］
ＲhCE 是将来源于正常人的表皮角质细胞、人永生化角膜上皮细胞及原代人角膜上皮细胞培养成多层高度分化的鳞状上皮组织，形成与人角膜十分相似的3D 模型。目前有3 种模型获得了OECD 的验证认可: The Epi-OcularTM EIT 模型，SkinEthicTM HCE EIT 模型及Lab-Cyte COＲNEA-MODEL24 EIT 模型。
将一定剂量的受试物( 液体受试物浓度大于60 μL·cm － 2，固体受试物浓度大于33 mg·cm － 2 ) 与ＲhCE 模型的表面充分接触，并在暴露后和暴露后的潜伏期用MTT 或WST-8 比色法测量细胞存活率，用于识别UN GHS未分类物质。ＲhCE 可作为“自上而下”及“自下而上”方法中的替代试验，尤其适用于“自下而上”方法中的初始替代试验。ＲhCE 不能够用于鉴定UNGHS 第1 类及UN GHS 第2 类物质，见表4。
3． 1． 5 荧光素渗漏试验( fluorescein leakage，FL) ［13］
荧光素渗漏试验属于基于细胞功能测定的试验。利用单层的犬肾小管上皮( madin-darby canine kidney，MDCK) 细胞暴露于受试物1 min 后，导致MDCK 细胞单层上皮荧光素钠渗透性的增加情况来判断受试物引起的眼毒性强弱。荧光素渗漏的量与受试物所诱导的细胞间紧密连接、桥粒连接及细胞膜损伤成正相关。
因此采用引起20% 荧光素渗漏的受试物浓度作为评价指标: 若FL20≤100 mg·mL － 1 则认为该受试物为UN GHS 第1 类物质。FL 法可作为“自上而下”和“自下而上”方法中的替代试验，尤其是适用于“自上而下”方法中的初始替代试验。FL 法不能用于鉴定UN GHS 第1 类及UN GHS 第2 类物质，见表5。
3． 2 其他替代试验方法
3． 2． 1 体外细胞试验方法
药物对眼部的毒性与其对角膜、结膜上皮及内皮细胞、视网膜色素上皮细胞的损伤有关。体外细胞试验通过检测细胞活力、细胞膜完整性、蛋白质的合成变性与释放、DNA 完整性、线粒体跨膜电位( MTP) 等来评价药物的眼毒性［14］。
3． 2． 2 Ocular Irritection( OI) assay
OI 试验能够用于评估受试物的眼刺激性是基于当角膜暴露于刺激性物质后会造成角膜蛋白质的摄动或变性，从而导致眼刺激和角膜混浊。该测试方法利用由生物提取的蛋白质、糖蛋白、脂质和低分子量组分的混合物组成的大分子试剂，当再水化时，形成有序的大分子基质，模拟透明角膜的结构。刺激性物质通过改变蛋白质构象和水合程度而使试剂的浊度发生变化。
通过测定试剂的浑浊度变化( 特定波长下OD 值的变化) 从而评估受试物的眼刺激性强弱。OI 试验显示了很好的不同实验室间的结果一致性，可用于鉴定UN GHS 第1 类化学品及UN GHS 未分类化学品。与同种适用分类并已验证的方法相比，其准确率、假阳性率及假阴性率基本一致。目前该方法仍在国际认可的验证中心进行同行评审，但已被ECHA 认可作为鉴定UN GHS 第1 类化学品的替代方法［15］。
3． 2． 3 微生理仪细胞传感器试验( cytosensor microphysiometer，CM)
CM 试验将小鼠L929 成纤维细胞培养在有传感器的小室中，利用pH 计检测培养基中酸值的变化，以反映细胞的代谢率变化情况［16］。受试物引起细胞基础代谢率下降50% ( metabolic ratedose 50%，MＲD50) 时的浓度作为反映细胞毒性大小的参数: 若受试物的MＲD50≤ 2 mg·mL － 1，则认为该受试物属于UN GHS 第1 类物质; 若MＲD50≥10mg·mL － 1，则该受试物被归为UN GHS 未分类物质。CM 法不能用于鉴定UN GHS 第2 类物质，CM 法已得到ECHA 及US EPA 的认可。
3． 2． 4 中性红释放试验( neutral red release，NＲＲ)
利用接近融合的单层细胞，暴露于连续稀释的受试物1 ～ 5 min，从剂量与反应关系曲线上推断引起前载中性红染料释放50%时的受试物剂量，从而判断受试物的眼刺激性强弱。尽管NＲＲ 法还没有通过验证，但ECVAM 及ESAC 认为其很有希望成为鉴定水溶性受试物是否属于UN GHS 未分类化学品的一种替代方法［17］。
3． 2． 5 离体兔眼试验( isolated rabbit eye，IＲE)
IＲE 试验与ICE 试验原理类似，通过定量检测角膜厚度、角膜浑浊度、荧光素滞留情况及肉眼观察形态学的改变来评价角膜上皮的损伤程度。IＲE 试验得到了ECHA 的认可，用于鉴别UN GHS 第1 类化学品［18］。
3． 2． 6 受精鸡卵绒毛尿囊膜试验( hen's egg test onthe chorio-allantoic membrane，HET-CAM)
利用受精鸡卵绒毛尿囊膜与眼结膜结构相似的特点，通过微血管及软组织膜蛋白质的变化情况来检测受试物的眼刺激性。HET-CAM 尤其适用于检测角膜损伤和受试物对血管系统的影响。试验方法为将受精鸡卵绒毛尿囊膜直接暴露于受试物，评定出血、血管破裂及凝血等急性反应［19］。
由于HET-CAM 试验存在不同的试验标准和预测模型， ICCVAM 认为HETCAM试验仍需进一步的工作来证明其科学性，但ECHA 认可HET-CAM 试验用于鉴定UN GHS 第1类化学品。
化学物质造成严重眼损伤或眼刺激主要取决于初次接触后造成损伤的程度，受试物的细胞毒性可用于解释其引起眼损伤或眼刺激性的机制［20］。轻微刺激物通常仅影响浅表角膜上皮，轻度和中度刺激物主要损伤上皮和浅表基质，严重刺激物损伤上皮、深基质甚至角膜内皮。
所以离体器官的替代方法( 如BCOP 和ICE 等) 包含完整眼组织结构的模型更适用于鉴定UN GHS 第1 类物质，而上皮模型和基于细胞功能的替代实验( 如ＲhCE，FL，CM 等)更适用于鉴定UN GHS 未分类物质［21］。
在ＲhCE 等替代方法中通常用组织活力作为评判受试物眼刺激性的标准。然而，这种评估方法可导致UN GHS 未分类物质被误鉴定为中度或弱眼刺激性物质的错误分类，从而降低替代方法的特异性和准确性。
因此，一些眼损伤生物标志物如cornifelin( CNFN) 、早期生长反应蛋白-1( early growth responseprotein-1，EGＲ-1) ［22］和人埃兹蛋白( EZＲ) ［23］等可作为生物标志物用于预测化合物的眼刺激性，从而更加全面地预测受试物的眼刺激性。
4
展望
体外眼刺激替代试验无法完全替代体内Draize的主要原因如下:
① 目前的体外替代试验数据不能直接评估受试物对虹膜的影响。
② 在体外实验中无驱动泪膜产生的神经源性组份，当缺少泪膜这层保护屏障时，与体内动物实验相比替代试验容易产生假阳性结果。
③ 体外替代试验不能评估眼睛暴露于受试物时可能造成的潜在全身毒性。但不可否认的是，体外眼刺激替代试验已成为化学品眼刺激安全性评价的发展方向，随着眼损伤生物标志物等替代方法的出现，体外眼刺激替代试验不断完善，最终也有可能完全取代传统的体内眼刺激试验，从而更加科学有效地对化学品的眼刺激性进行分类。
参考文献
中国新药杂志 2020 年 第 29 卷 第 6 期
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