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动物行为实验指南丨小鼠嗅觉行为的评估：气味检测和习惯化

萌宠菠菠乐园
2024-09-26 01:28

撰稿丨脑声常谈瑾瑜（笔名）

排版丨脑声常谈编辑团队

嗅觉对啮齿类动物的进食和交配、建立社会和领土关系或构建捕食关系等方面至关重要。来自嗅觉黏膜的感觉输入首先在主嗅球（MOB）中被处理，而神经元功能障碍引起的MOB环路的改变或神经元间转换率的改变以不同的方式影响嗅觉。研究表明，成人MOB神经发生的改变会影响其气味辨别的能力，这种现象可通过习惯化-去习惯化测试进行分析。本文提出了一个用于定量评估两种嗅觉任务的简单方案，可用于检测MOB中的神经源性改变。

材料和试剂

A.动物

CD1和C57BL/6J雄性小鼠，每笼4-5只，在控制温度（23 ± 2°C）和湿度的环境中，进行12-12小时的光-暗循环，并给予充足的食物和水。只使用一种性别可以减少个体间的差异，而用雄性代替雌性，可以避免与发情相关的循环激素效应。

注：所有小鼠的年龄必须相同或相似（年龄差少于两周，因为神经发生的速率与年龄密切相关）。建议每组10-12只小鼠，以尽量减少个体间差异的影响。

B.气味

气味剂必须具有非情感意义。本文使用两种合成气味：柠檬样柑橘味的香叶腈（3,7-二甲基-2,6-辛二烯腈）和甜玫瑰味的香叶醇（3,7-二甲基-3,7-辛二烯-1-醇），稀释度在1：160到1：10之间。因为合成香料通常以油酸形式存在，所以本研究使用矿物油来稀释它们，随后将它们放在密封的容器里，以减少它们的蒸发。

C.其他材料

1.矿物油（Sigma-Aldrich，目录编号：M5904）

设备

嗅觉实验应在有正压（10-15 gauges）和频繁空气交换（不少于20次每小时）的实验房间内进行，以快速去除气味。建议在昏暗的照明灯间接照射下进行测试。气味剂的稀释应在另一个隔离房间里进行。

所使用的材料为（见图1）：

1.一个22.5 x 22.5 x 29.5厘米的开放式绿色有机玻璃盒。位于盒子底部上方8厘米，侧棱11.2厘米处有一个直径1厘米的洞。建议采用透明的甲基丙烯酸甲酯盖，以避免测试过程中的气味挥发。录像系统固定在探测箱上方，距离透明盖30-40 cm处。

注：嗅觉探索盒可以根据描述进行定制。盒子用10%的酒精彻底擦拭干净，并在每轮实验前后进行干燥。每次测试后，必须用家用真空吸尘器小心地去除用过的弄脏的垫料，并换上新垫料。使用无臭的一次性纸巾和丁腈手套进行清洁和干燥。

2.普通棉棒

3.计时器

4.微量移液枪(2-20或20-200µl）；一次性枪头

5.胶带

6.1.5 ml的离心管，以保存气味剂原液；一个微离心管架，以避免离心管翻转。

一个密封的容器（密封的垃圾袋也可以），用于处理所有浸渍了气味剂的物品。

图1|设备和材料（测试箱的照片和一些所需的材料，其排列顺序与它们在文中出现的顺序相同。箭头指向引入浸染香味的棉棒进入测试盒的孔）

实验设计

A.阈值检测

该方案旨在通过确定个体可感知到的某种气味的最低浓度来测量其对气味的敏感性。

将要接受测试的那组小鼠关在不同房间的通风橱里。每只老鼠取出后放在一个空的干净盒子里，运送到测试室。测试结束后，将小鼠返回原笼，并清洁运输箱。

1、适应测试条件

首先将测试小鼠暴露于测试环境中。

a.将小鼠轻轻地放置在测试盒（图2）中，测试盒底部覆盖着一层不超过1厘米高的垫层。本文建议在测试期间用透明的盒子盖。

b.让小鼠进行3分钟的自由探索时间来适应测试环境

c.不含有气味剂的棉签通过盒璧上的小孔被引入盒内。棉签应探出墙面约3厘米，并固定1 min。

d.第一次接触上述棉签后，应再连续4次接触新的浸泡不含气味剂的棉签，以形成对棉签以及棉签进出箱子这个动作的习惯化。这部分测试还可以揭示不同个体对陌生对象的探索性反应的差异。

e.使用VisuTrack视频追踪系统（上海欣软）记录小鼠在整个测试过程中的行为。

图2|测试盒中的小鼠状态（被评估为嗅觉探索的动作包括触摸棉签或嗅，或将鼻子靠近棉签）

2、阈值检测

在5次无气味刺激试验后，小鼠将继续对含有一种气味剂但浓度不同的棉棒进行嗅觉测试（以1：160、1：80、1：40、1：20和1：10用矿物油稀释），以确定触发其嗅觉探索的最低浓度。本文通常使用香叶腈来完成这项测试。

a.与之前无气味棉签操作类似，将含最低香叶腈浓度的棉签引入盒内，并放置1 min。

注：每次试验都使用一根新的棉签，并立即将用过的棉签放在密封的容器或密闭垃圾袋中。

b.使用一根无气味棉签重复上述操作。

c.使用香叶腈浓度更高的棉签重复操作。

d.然后重复这个过程，直到测试出所有的浓度。

e.使用VisuTrack视频追踪系统（上海欣软）记录小鼠在整个测试过程中的行为。

试验间隔（ITI）定义为暴露于各种气味之间的时间。这个间隔应允许实验鼠对每一根棉签表现出特定的嗅觉行为，避免使其对棉签失去兴趣。对于此测试，本文建议ITI为1-2 min。本研究使用了一分钟的ITI，在此期间将小鼠暴露在一根浸渍了矿物油的棉签中（见步骤A2g）。

在本测试中所分析的对照组和实验组小鼠的行为表现的差异表明了两组小鼠的嗅觉感知能力的差异（图3A）。

B.嗅觉的习惯化-去习惯化

将这些小鼠暴露在两种不同的气味中，以测试其嗅觉辨别能力。该方案旨在测试小鼠对特定气味的习惯化，表现为在连续的测试中对该气味棉签探索时间的逐渐减少，以及去习惯化，表现为对一种新的、独特的气味的探索增加。

第二次测试应该用一组新的小鼠进行，因为陌生的和熟悉的气味编码不同，气味的熟悉程度可能会影响小鼠嗅觉探索和感知的刺激程度。

1.对测试条件的适应（参考A中的第1节）。

2.习惯/去习惯化：在5次无气味刺激的试验后，将小鼠暴露于其中一种气味中五次，然后暴露于另一种气味中5次。

注意：所有气味浓度必须同时高于对照组和实验组的嗅觉阈值。本文采用1：20的稀释浓度。

a.浸渍1：20稀释浓度的香叶醇的棉签引入盒内，放置1 min。

b.使用无气味棉签重复上述操作。

c.步骤B2a-b再重复4次。

d.将浸渍1：20 稀释浓度的香叶腈的棉签引入盒内，放置1 min。

e.使用无气味棉签重复上述操作。

f.步骤B2d-e再重复4次。

g.使用VisuTrack动物行为视频追踪系统（上海欣软）记录小鼠在整个测试过程中的行为。

习惯化反映为第一次或第一次和第二次暴露于相同气味后小鼠的探索气味时间的减少；去习惯化反映为对新气味刺激的探索时间增加（见图3B）。

使用适合于测试的气味浓度是很重要的。相同的气味分子可以根据其浓度诱导吸引或排斥反应。此外，嗅觉感觉受体在非常高的嗅觉浓度下可能无法产生动作电位。本文建议在阈值检测测试中使用所有动物都能清晰感知嗅觉刺激的最低浓度，本研究在CD1和C57BL/6J小鼠中使用香叶醇和香叶腈浓度分别为1：40或1：20。

图3|实验结果（A.阈值检测测试。直方图显示在不同浓度的香叶腈中的平均探索时间（以秒为单位）。B. 习惯-去习惯化测试。该图显示了在矿物油、香叶醇（1：20）和香叶腈（1：20）的连续试验中显示平均探索时间（以秒为单位））

数据分析

在实验结束后，评估每只老鼠进行任何类型的嗅觉探索动作所花费的总时间。被评估为嗅觉探索的行为包括触摸棉签或闻，嗅，或使鼻子靠近棉签。

统计分析使用重复测量的混合模型方差分析（“试验”因素），然后进行事后比较（例如Tukey或Bonferroni测试）来确定习惯化和去习惯化的发生。最后，可以在方差分析中添加一个“between-subjects”因子，用于两个实验组的比较。统计学差异（p˂0.05)用*（非习惯化）和#（习惯化）表示。

参考来源