动物行为实验指南｜带大家了解动物碎巢和筑巢测试实验方法和注意事项
在动物模型中模拟人类精神疾病和神经发育障碍目前仍具有挑战。小鼠作为一种广泛使用的模型系统，已经可以用来研究这些疾病的病理生理过程和相对应的治疗策略。然而，相应的行为学测试往往需要丰富的行为测试经验。本文提出了两种简单的行为学方案——筑巢和碎巢（Nestlet Shredding，指扯碎筑巢垫料），这两项方案可以验证小鼠模型的精神疾病（潜在）特征。这两种测试以前都已经报道过，本文根据实践经验对其进行了改进，比如使用熟悉的家庭笼替换陌生的新笼子。综上所述，本文为两种行为学测试提供了现成的使用方案，允许以最小的时间和成本产生可靠稳定的数据，并能够对这些小鼠疾病模型中的精神或神经发育障碍的特征进行初步评估。
关键词：行为，自闭症，神经发育障碍，重复刻板行为，应激，神经系统疾病，小鼠模型
研究背景由于人类大脑无与伦比的复杂性，很难用动物模型来模拟精神和神经发育疾病的特征。然而，尽管存在一些局限性，近年来在小鼠身上已经开发出了一系列针对这些疾病的行为学测试。许多这些检测方法现在被广泛接受为研究疾病机制或治疗方法的有效工具。本文展示了两个简单的测试，碎巢和筑巢，该测试广泛用于研究包括神经发育障碍在内的精神疾病的潜在特征，本文最近用该测试来表征基因缺陷导致的合成醚脂障碍小鼠的行为表型。醚脂是具有广泛生物活性的化合物，调控细胞膜的结构维护和信号转导，对大脑的正常功能的维持尤其重要。因此，醚脂缺乏小鼠表现出包括运动障碍、多动和记忆缺陷，以及社交和新物体识别缺陷在内的复杂行为缺陷。
这两种分析方法都有几个明显的优点：它们都是低成本的实验，在相对较短的时间内可以获得大量的数据。此外，它们可以由只有适度的行为分析经验的研究人员可靠地执行。这两种测试都几乎不依赖于动物的身体能力，因此允许使用具有显著表型的转基因小鼠模型。例如，本文使用了具有相当大发育缺陷和视觉障碍的小鼠（缺乏醚脂的Gnpat敲除（KO）小鼠模型）。当然，分析的简单性也有一些缺陷：两种测试都只能用来对神经发育障碍潜在特征进行初步评估。此外，研究结果需要详细解释，比如：过度的碎巢通常被视为重复行为的一个指标，这种症状也可以在人类自闭症谱系障碍或强迫症中看到。相反，碎巢的减少可能被视为对新事物的兴趣有限。本文认为这两种解释都是有效的，但需要在某个小鼠模型的行为的其他方面进行考虑。反过来，筑巢也可以预示着总体上的幸福、悲伤或疼痛。
本文所描述的两种测试程序主要是对之前的方案进行了轻微修改。此外，本文还提供了对测试方案的更详细描述，包括关于测试环境的新建议和对程序和结果的扩展说明，并分享了在测试执行和分析方面的经验。
材料和试剂1. 棉纤维Nestlet筑巢垫料(Ancare公司; 产品编号：NES3600; 每只小鼠一份)
2. 带标签的塑料袋（存放Nestlet垫料）
3. 动物
对于目前的方案中使用的小鼠品系没有任何限制。
设备1. 称量天平（最小精度：0.1 g)
2. 用新鲜干净的垫料清洁鼠笼（普通垫料即可）
3. 摄相机
4. 计时器
5. 手术钳
6. 玻璃或有机玻璃板；尺寸取决于测试所用的笼的尺寸（板应足够大以更换笼盖）
软件1. 标准统计软件：Prism (GraphPad；版本6或更高版本）、Sigma Plot (Systat；版本11.0或更高版本）或类似软件
2. 视频跟踪软件（例如，上海欣软VisuTrack动物行为视频跟踪软件或类似软件）
实验流程A. 碎巢试验
1. 在测试前至少7天。检查小鼠生活条件是否符合共同标准，如控制照明（本文使用12：12小时的光-暗循环照明系统）、温度和湿度以及低噪音水平等。
2. 在测试前24小时，将测试小鼠的笼子中的任何可用于筑巢的材料移除。
3. 在测试当天，将测试动物转移到测试区域。确保小鼠对实验环境习惯化，以避免其分心。可在测试前的几天，把测试小鼠置于试验区进行习惯化，每天至少持续1小时。
4. 从实验动物的笼子里取出食物和水，用一个表面光滑的透明物体代替盖子，比如（玻璃或有机玻璃）板，以防止老鼠在测试期间攀爬。
5. 用镊子取一块Nestlet筑巢垫料，称量一下，放在测试动物的笼子里
6. 在试验开始时拍照，确保文件记录。或者使用自动视频追踪系统。
7. 启动计时器。在30 min的观测期内，实验者距离试验区至少保持1m。
8. 30 min后，停止试验，轻轻地将试验动物从笼中取出。确保所有的筑巢材料都留在笼子里。
9. 使用摄像机记录试验结束后的状态（图1）。
10. 取下Nestlet筑巢垫料，称一下。如果Nestlet筑巢垫料被撕成几块，用最大的一个。取出的Nestlet筑巢垫料不包括在移除巢座时脱落的碎片。
11. 将Nestlet筑巢垫料样本放在塑料袋中以备记录并标记上测试小鼠编号。
12. 当按顺序测试动物时，应在对照组之间交替测试，以避免分析中的偏差。
图1|野生型和醚脂缺乏（GnpatKO）小鼠的碎巢实验结果（A.所有实验动物在30分钟观察期后记录Nestlet巢材料状况（每个基因型n=9）。面板内的数字表示测试ID（黑色：野生型；红色：Gnpat KO)。与Gnpat KO小鼠相比，野生型小鼠的粉碎活性明显提高。B. 计算各试验动物试验前后巢穴重量的差异，结果以单个数据点表示。灰色条表示平均值。数据点旁边的数字表示鼠标测试ID）
B. 筑巢试验
1. 同A1。
2. 同A2。
3. 避免任何可能导致测试结果产生偏差的设置（例如，在空间上将不同的测试组分离）。
4. 在测试当天（最好是在晚上），用干净的镊子为每只测试鼠提供一块筑巢材料。
5. 摄像机记录测试开始时状态。
6. 20小时后，记录下实验状态（可标记为“t20”）。
注：不要破坏筑巢材料——要等到测试小鼠要么稳定地坐在它的所筑的巢穴里（确保巢穴清楚可见），或者自愿离开它的巢穴。不要让小鼠强行离开巢穴。
7. 48小时后，将实验小鼠转移到一个干净的笼子中，结束试验。记录最后的巢穴状态，并避免打乱巢穴。
数据分析A. 碎巢试验
1. 对于每只实验动物，计算试验前后的巢的重量之差（图1）。
2. 不可排除未进行碎巢活动的小鼠，因为这可能会在你的分析中产生偏差。因此，只排除那些明显受损（如受伤）或身体无法执行实验的小鼠。然而，这应该在进行试验之前完成。
3. 使用统计学软件来比较测试组小鼠。对于符合正态分布的测试结果，可以使用参数检验。然而，对于本文使用的小鼠品系，有许多小鼠的测试结果值等于0，因此本文使用非参数检验，如Mann-Whitney U-检验（用于两组的比较）或克鲁斯卡尔-沃利斯检验（用于两组以上的比较）。
B. 筑巢试验
1. 为了评估筑巢效果，需要2-3名没有参与测试的独立研究人员。
2. 不可排除未进行碎巢活动的小鼠（同A2）。
3. 根据之前发布的评分方案（表1和图2），从1（非常差/没有筑巢)到5(最佳筑巢）对筑巢进行评分。评估人员必须对试验动物的基因型或治疗组不知情。
图2|筑巢测试中得分情况（注：1分表示测试小鼠从未接触巢。然而，本测试队列中，没有任何小鼠的评分低于2分）
4. 使用非参数检验来比较每个时间点的测试组小鼠。
注意事项1. 和任何行为实验一样，确保在一天中的同一时间测试所有的动物，且最好是在晚上开始测试。
2. 之前的方案大多在新的陌生笼里破碎巢材料。然而，本文使用的小鼠品系在不熟悉环境中的兴趣增加，减少了碎巢活动。为了避免这种使测试小鼠分心情况，本文在小鼠熟悉的家庭笼中进行了实验，这明显增加了碎巢活动，使之产生了具有显著差异的结果（图3）。
图3|同只小鼠在熟悉笼和新的陌生笼内的碎巢结果不同（同一组小鼠（n = 8）在一个装满新鲜垫料的陌生笼子（“fresh cage”）中进行碎巢试验，一周后，在它们的家庭笼子中重复测试。所连接的数据点来自于同一个测试小鼠。值得注意的是，有三只不同的小鼠达到了相同的碎巢评分（新鲜笼0g，家笼0.1g）。*p < 0.05）
3. 额外数据可以通过连续几天重复的碎巢试验来收集。然而，本实验没有重复测量，以避免试验鼠对测试任务的习惯化。
4. 可以多测试几种用于筑巢测试的筑巢材料。在本研究中，与纸巾、厨房卷或棉絮相比，nestlets巢材料所得结果重复性最佳，实验结果最显著（图4）。
图4|筑巢试验所用不同材料类型的比较（A.未切割的厨房卷。B. 切割的厨房卷。C.一条切成条的纸巾。D.棉絮。E. nestlets巢材料。）
5. 在筑巢测试中分析巢的时间点要确保至少覆盖一个夜间的时间，因为该时间段是小鼠的活动阶段。
6. 两性小鼠均可用于测试。为了尽量减少变异性，雄性小鼠和雌性小鼠应该分别进行分析。但在这种情况下，必须对多次比较进行统计校正。
7. 该方案对于实验动物的年龄限制不大。基本上，任何年龄的成年动物都可以被使用。然而，通常建议保持年龄范围尽可能窄，以避免年龄变异带来的实验误差。此外，转基因模型的表型可能会随着年龄的增长而改变，从而影响行为分析的表现。
8. 这两种测试都可以在同一组动物中进行。然而，为了避免对nestlets巢材料的习惯，试验之间应保持7天的休息间隔。
9. 本实验使用了一个混合背景品系（远系繁殖的C57BL/6 x CD1）的小鼠。这些动物在筑巢中的行为表现比较可靠。然而，据报道，筑巢行为经常随环境条件而变化，因此应该在使用的小鼠品系的测试队列中获得基线数据以作参考。本文使用的小鼠品系的平均碎巢活性与之前描述的相似。
10. 如果使用的是小鼠品系/基因型/处理条件，不能产生良好的筑巢结果，那么用于筑巢的筑巢材料的百分比可以作为一个替代参数——即在试验之前，称一下巢材料重量，试验结束后，称重未用于筑巢部分的重量，计算已转化为巢的巢材料的比例。
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