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抗氧化剂化合物用于肌肉复原的用途的制作方法

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2024-10-09 03:36

专利名称：抗氧化剂化合物用于肌肉复原的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗氧化剂化合物用于保持或恢复肌肉健康的用途。这些化合物可用于制造下述组合物，所述组合物用于保持或恢复肌肉健康，由此例如预防和/或治疗锻炼导致的肌肉损伤。更具体地，此类组合物包括食物、饮料、补充剂和饲料。
运动员要进行常规的强烈和/或长时间的肌肉锻炼。研究表明，在艰苦的锻炼期间，活性氧物质(ROS)的产生被提高至超过了组织抗氧化防御系统的水平。其结果是氧化胁迫(oxidative stress)，这可能对组织(例如肌肉组织)造成损伤。通常，良好的肌肉健康状况对于其性能来说非常重要，尤其是骨骼肌的。锻炼因此可能损伤肌肉健康，导致例如疲劳、较低的耐力、损失功能。已提出用抗氧化剂补充剂来预防此类损伤(Dietaryanti-oxidants and exercise，Journal of Sports Sciences，2004，22，81-94，Powerset al.)。
但是并非所有抗氧化剂都适用于复原肌肉损伤。研究已显示，一些抗氧化剂几乎没有作用。这可能由于多种原因。首先，抗氧化剂的生物可利用性可能较低。因此肠对抗氧化剂的吸收相对较低，导致需要大量的抗氧化剂来发挥作用。第二，并非所有抗氧化剂都能通过肌肉细胞的膜。此外，一些抗氧化剂使用中被消耗，还使得必须要有相对高含量的抗氧化剂的摄取来获得效果。而不管从健康的角度(体内很多代谢产物)还是从成本的角度来看，这都不是人们想要的。
一些抗氧化剂已知能在所谓的抗氧化剂网络(network)中再生，例如，维生素E通过维生素C再生。但是关于维生素E的体内研究没有显示出对于抗氧化剂标记的任何显著效果。
本发明的目的是提供适用于肌肉复原的组分，其可参与抗氧化剂网络，并且具有良好的生物可利用性。
令人吃惊地，我们发现，根据结构式(1)的可食用化合物可用于保持或恢复肌肉健康其中R可以是H、OH或CH3O；R1可以是H或(CH2)nOR2，其中，n是1、2或3，R2是H、COCH3或其中，m是1、2或3前提条件是R和R1不同时为H。
合适的根据结构式(1)的化合物的例子是羟基酪醇(hydroxytyrosol)及其乙酸酯、橄榄苦苷(oleuropein)、对羟苯基乙醇(tyrosol)及其乙酸酯、高香草酸醇(homovanillic alcohol)和/或邻苯二酚(cathechol)。这些化合物的混合物也可以使用。
我们吃惊地发现，该化合物可用维生素C再生。这使得根据结构式(1)的化合物适于制造用于预防或治疗氧化胁迫导致的肌肉损伤的组合物。
优选地，R是OH。更优选地，至少羟基酪醇或其乙酸酯用于组合物中。羟基酪醇具有额外的优点其是两性的。其可溶解于水性和脂肪组合物中，例如细胞内或细胞外流体和膜中。
根据结构式1的化合物可用于制造用于治疗或预防肌肉损伤的组合物。优选地，该组合物不含红景天苷(salidroside)。
本发明的另一个方面是根据本发明的用途，其中，适用于肌肉复原的组分被用在适合人类使用的营养产品中。任何营养产品都可能是适合的，例如，食物、饮料或膳食补充剂。优选地，营养产品不是口香糖。
优选地，根据结构式(1)的抗氧化剂化合物存在于运动员摄取的运动营养产品中。已知运动员可从针对普通人群的推荐膳食指导之外的特殊食物或食物成分中获得好处。术语“运动营养产品”在本文中被用来表示特别针对运动员改良过的任何食物或饮料。
有多种适于本发明目的的运动营养物，例如特定膳食补充剂、运动饮品或运动食物。
运动饮品可以是低渗的、高渗的或者等渗的。运动饮品可以以液体形式、作为浓缩物或作为粉末(待溶解于液体，例如水中)获得。运动食物可以是条棒状、片剂或凝胶的形式。膳食补充物可以是药丸或胶囊的形式。
营养物还可包含常用添加剂，例如加甜剂、香料、糖、脂肪、乳化剂、防腐剂。营养物还可包含其它活性组分，例如(经水解)蛋白质，如WO02/45524所述。此外，营养物中还可存在其它抗氧化剂，例如类黄酮、类胡萝卜素、泛醌、芸香苷、硫辛酸、过氧化氢酶、谷胱甘肽(GSH)和维生素，例如维生素C和E或其前体。根据结构式1的化合物和维生素C或其前体的组合已显示出了协同效果。优选地，羟基酪醇或其乙酸酯与维生素C组合物。包含根据结构式1的化合物和维生素C的组合物是新颖的，其是本发明的另一个方面。
根据结构式1的化合物需要以有效量存在。通常，每份需要1mg至3克之间的化合物以提供效果，优选地，每份10mg至1克之间。这取决于很多因素，例如，体重、年龄、膳食习惯和锻炼强度。抗氧化剂的效果可通过某些标记来测量。在肌肉锻炼中，脂类氧化和蛋白氧化都会发生。针对脂类氧化的量的待测合适标记是例如丙二醛(malondialdehyde，MDA)以及异构前列腺素(isoprotane)。针对蛋白氧化的量的合适标记是例如蛋白羰基。
包含根据结构式(1)的化合物的营养物可在锻炼之前、期间或之后食用。当在锻炼前使用的情况下，优选在之前大约一小时时食用。在锻炼后使用的情况下，优选在之后一小时内食用，更优选在锻炼后立即食用。
除了适合人类使用的营养产品之外，还可在用于动物的饲料(包括宠物食品)中使用根据结构式(1)的化合物。因此这尤其适用于那些因为肌肉力量被使用的动物，例如(赛)马或犬(即，赛犬或雪撬犬)。
下文中通过下述非限制性实施例来阐述本发明。
实施例实施例1 器官浸浴(bath)实验使用雄性Lewis大鼠(12至14周龄之间)。断头处死后，迅速切下横膈(diaphragm)，切成小条带(大约2mm宽，1cm长)，随后放进恒温器官浴(含有Krebs缓冲液，用95％O2和5％CO2的混合物对其充气，pH 7.4)中。每条横膈条带与等容传感器(isometric transducer)垂直相连。Krebs缓冲液的组分是(mM)NaCl(117.5)、KCl(5.6)、MgSO4(1.18)、CaCl2(2.5)、NaHPO4(1.28)、NaHCO3(25)和葡萄糖(5.5)。实验期间，缓冲液每15分钟换一次。用铂电极在每条肌肉条的全长上制造场刺激(field stimulation)。
在实验开始时，在室温下45分钟期间洗条带，以使得温度依赖型偏差最小。之后，打开水浴为37℃(在实验开始前15分钟)。用颤搐收缩(1Hz)先将每条条带调节至其最优长度(Lo)。脉冲持续总是10ms。
首先测定Pt(1Hz刺激下的颤搐张力)和Po(在100Hz的刺激，250ms持续情况下的最大比张力)。之后，通过以250ms应用10、20、33、50和100Hz的脉冲，在Lo测定横膈肌条带对于逐渐增加的刺激的应答。在收缩之间使用2分钟的复原期。在力-频率方案完成后，应用疲劳方案。在5Hz下对条带进行6分钟的刺激。该刺激方案后，羟基酪醇(HT)或对照(运载体，乙醇)孵育5分钟。随后，过氧化氢(H2O2)或对照(MilliQ)孵育10分钟。之后再测定Pt、Po、力-频率和疲劳。
羟基酪醇购自Cayman Chemical，Ann Arbor，USA。过氧化氢从Sigma，St.Louis，USA获得。所有其它化学品都是分析纯级别的。

图1显示了H2O2对肌肉力量的作用。在应用的所有刺激频率下，较之对照，H2O2都剂量依赖性地降低力量。数据作为基于至少两次重复测量的平均值表示。
图2显示了HT针对H2O2介导的肌肉损伤的的保护作用。在所有刺激频率(10、20、33、50和100Hz)下，HT针对H2O2介导的肌肉损伤均提供保护。没有H2O2孵育的300μM HT甚至保持了肌肉功能。数据作为基于至少两次重复测量的平均值表示。
图3显示了HT针对H2O2介导的肌肉损伤的的保护作用。HT针对H2O2诱导的力量减少提供剂量依赖性的保护。刺激频率为50Hz，H2O2浓度为1mM。数据作为基于至少两次重复测量的平均值表示。
实施例2 清除实验以及与硫辛酸的比较材料羟基酪醇购自Cayman Chemical，Ann Arbor，USA。对羟苯基乙醇和KO2购自Fluka，Buchs，Switzerland。高香草酸醇、2-甲氧基苯酚、苯酚以及二氢若丹明-123(DHR-123)获得自Sigma，St.Louis，USA。邻苯二酚获得自Janssen Chimica，Geel，Belgium。硫辛酸购自Asta Medicac AG，Frankfurt，Germany。一氧化氮购自AGA，Hamburg，Germany。所有其它化学品都是分析纯级别的。
ONOOH清除按照Kooy et al(Peroxynitrite-mediated oxidation of dihydrorhodamine123.Free Radic Biol Med，16；149-56)所述来测量针对ONOOH诱导的化合物DHR-123氧化的保护。简言之，在100mM磷酸钠缓冲液(pH 7.4)中于37℃孵育5μM的DHR-123和多种浓度的清除剂(scavernger)。随后，在快速震荡下向管中移入10μl的一份来ONOOH，达到0.7μM的终浓度。用分别为500nm和536nm的激发波长和发射波长来进行荧光测量。以提供对DHR-123氧化的50％抑制的清除剂的浓度(IC50)来表示效果。
O2·-清除O2·-通过黄嘌呤(150μM)和黄嘌呤氧化酶(XO)(5.5mU/ml)在50mM磷酸钾缓冲液(pH 7.8)中的反应产生。通过氮蓝四唑(NBT，50μM)来检测O2·-自由基。NBT经历O2·-的还原，成为其甲臜(formazan)。在2分钟期间，于560nm对该还原的速率进行分光光度监测。加入多种浓度的清除剂，在37℃孵育。通过加入XO来起始反应。O2·-清除能力被表示为使NBT还原降低50％的清除剂的浓度(IC50)。为调节清除剂对XO活性的可能的抑制影响，在37℃孵育最高浓度的清除剂，随后在2分钟期间于293nm测量尿酸盐形成的速率。
清除试验的结果显示于下表1中。
表1试验化合物对于ONOO-和O2·-的清除活性。显示为IC50值±SEM(以μM表示)，n＝3。
实施例3 羟基酪醇(HT)通过抗坏血酸盐/酯的再生HT(Cayman Chemical，Ann Arbor，USA)的氧化在145mM磷酸缓冲液(pH 7.4，含有50μM HT和5U/ml酪氨酸酶(Sigma，St.Louis，USA))中于37℃进行。对酪氨酸酶和HT的孵育导致醌(HTQ)的形成。通过分光光度方法和高效液相色谱(HPLC)对反应加以监测。以240nm/分钟的扫描速度记录光谱。使用Supelcosil LC318柱进行孵育混合物的HPLC分析。用含有0.1％(v/v)三氟乙酸和5％(v/v)乙腈的蒸馏水以每分钟1ml的流速对柱进行洗脱。使用280nm处的二极管阵列检测(DAD)。抗坏血酸盐/酯与HTQ反应的能力按照下文所述来测定。首先，在两分半钟期间形成HTQ。随后，向HTQ中加入150μM抗坏血酸盐/酯(Sigma，St.Louis，USA)，立即在三分钟手工将混合物注射进HPLC。
图4显示了仅HT时的HPLC测量结果(对照)。
图5显示了向HT加入酪氨酸激酶(tyrokinase)的效果，由此显示了其醌的形成(对照)。
图6显示了向HT和酪氨酸激酶的混合物加入抗坏血酸盐/酯的效果。
其显示，HT再次形成，三分钟后不再存在HTQ。HT通过抗坏血酸盐/酯的再生已发生(实施例)。
实施例4 包含羟基酪醇的曲奇饼配方活性成分羟基酪醇10-50mg/每份(典型的为30g)
所有成分都在混合下缓慢加入，以形成甜味油酥团。之后，将油酥团冷藏(4℃)至少2小时，之后将油酥团碾平为大约5mm的厚度。切成块，烘焙之前表面刷上蛋黄。烘焙可于180℃在风烤箱(fan oven)中进行15分钟。
权利要求
1.包含根据结构式(1)的化合物的组合物用于保持或恢复肌肉健康的用途其中R可以是H、OH或CH3O；R1可以是H或(CH2)nOR2，其中，n是1、2或3，R2是H、COCH3或其中，m是1、2或3前提条件是R和R1不同时为H。
2.根据结构式(1)的化合物在制造用于保持或恢复肌肉健康的组合物中的用途其中R可以是H、OH或CH3O；R1可以是H或(CH2)nOR2，其中，n是1、2或3，R2是H、COCH3或其中，m是1、2或3前提条件是R和R1不同时为H。
3.如权利要求1-2中任意一项所述的用途，其中，所述化合物是羟基酪醇、其乙酸酯或其前体。
4.如权利要求1-3中任意一项所述的用途，其中，其中所述组合物额外包含另一种抗氧化剂。
5.如权利要求4所述的用途，其中，所述额外的抗氧化剂是维生素C。
6.如权利要求1-5中任意一项所述的用途，其中，所述组合物是饮料、膳食补充剂、食物或饲料。
7.用于制备饮料、膳食补充剂、食物或饲料的方法，其特征在于，向其中加入包含根据结构式(1)的化合物的组合物，用于保持或恢复肌肉健康其中R可以是H、OH或CH3O；R1可以是H或(CH2)nOR2，其中，n是1、2或3，R2是H、COCH3或其中，m是1、2或3前提条件是R和R1不同时为H。
8.如权利要求6所述的方法，其中所述食物、饲料或饮料包含每份至少1mg的根据结构式(1)的化合物。
9.一种组合物，其包含维生素C或其前体以及根据结构式(1)的化合物其中R可以是H、OH或CH3O；R1可以是H或(CH2)nOR2，其中，n是1、2或3，R2是H、COCH3或其中，m是1、2或3前提条件是R和R1不同时为H。
10.包含根据权利要求9的组合物的食物、饮料、膳食补充剂或饲料。
全文摘要
本发明描述了下述组合物用于保持或恢复肌肉健康的用途，所述组合物包含根据结构式(1)的化合物，结构式(1)中R可以是H、OH或CH
文档编号A61K36/00GK101060794SQ200580039200
公开日2007年10月24日申请日期2005年11月15日优先权日2004年11月16日
发明者阿利亚·卡斯特·济斯, 萨斯卡·约翰内斯·瑞提基斯, 盖德·瑞勃图斯·米歇尔·马莉亚·哈恩, 阿尔特·巴斯特申请人:帝斯曼知识产权资产管理有限公司