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脑声常谈丨动物原发性震颤模型及行为评估

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2024-10-09 04:24

特发性震颤（Essential tremor, ET）是最常见的的运动障碍性疾病之一，其定义为以双侧上肢动作性震颤为特征的孤立性震颤综合征；持续时间至少3年；其他部位有或无震颤(如头部、声音，或下肢)；无其他神经体征，如肌张力障碍，共济失调、帕金森症。其震颤症状多在运动及紧张时加重，休息时减轻，约50%的患者饮酒时可出现震颤症状的缓解。

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造模

在实验前使用Harmaline Hydrochloride Dihydrate和生理盐水配置新鲜溶液。继续使用前述实验的同一批小鼠进行造模，对已经灌胃了不同菌群的两组小鼠每只腹腔注射10mg/kg体重的Harmaline Hydrochloride Dihydrate，以制造急性震颤模型。

Harmaline实验

将12周Ucp4fl/fl、Pcp2cre;Ucp4fl/+与Pcp2cre;Ucp4fl/fl雄性小鼠标记后称重，每只按照10mg/㎏剂量腹腔注射Harmaline溶液，之后小鼠立刻放在旷场中，记录15min；录制5min高架十字迷宫实验，之后小鼠录制5min视频，用于震颤评分；最后，小鼠进行VisuGait步态实验记录。

Fig1 Harmaline诱导特发性震颤实验流程图

小鼠在注射10mg/kg剂量Harmaline后，分别进行以下行为学实验，同时通过录像来分析小鼠震颤评分，0分：没有震颤；1分：偶见头和尾巴震颤；2分：偶见全身震颤；3分：持续头和尾巴震颤；4分：持续全身震颤；

震颤评分

由两名观察者进行震颤评分。注射完药物到开始出现震颤症状之间的时间被记录为震颤发作的时间。记录震颤持续时间为从震颤发作到完全消失的时间。每隔一定时间(每30分钟)评估震颤强度，直到震颤完全消退，动物恢复正常。评分标准如下：0:没有震颤。1:偶尔的震颤影响只有头部和颈部。2:间歇(偶尔的震颤影响到所有身体部位)。3:持久(持续的震颤影响所有身体部位和尾巴)。4:严重(持续震颤使动物无法站立或行走)。

造模后行为学测试

在震颤评分的同时进行前述各项行为学测试。因预实验中发现两组小鼠在整个震颤期间表现有所差异，因此在震颤期间各时间点反复进行行为学测试，具体方法如下：特发性震颤患者粪便改变小鼠旷场中行动路程及平均速度。

对两组小鼠在5分钟内的运动总路程、平均运动速度、活动时间进行比较。两组小鼠的整体运动能力之间存在明显差异。特发性震颤患者菌群组的小鼠行动的总路程小于健康菌群组，平均速度小于健康菌群组，活动时间短于健康菌群组健康菌群组，站立次数少于健康菌群组。

Fig2 小鼠初始旷场测试结果

(a)小鼠在旷场中的平均行动轨迹热图。ET：特发性震颤菌群组(n=15)，HC：健康菌群组（n=15）。

(b)小鼠在旷场中的5分钟内总活动路程。

(c)小鼠在旷场中的行动平均速度。

(d)小鼠在旷场中的活动时间。

(e)小鼠在旷场中的站立次数。

加速转棒实验方法

实验动物适应：所有行为学实验在下午两点至六点半进行测试，在测试前将动物放在行为室适应三十分钟。在将动物放到仪器上后启动仪器，旋转棒开始加速，最终最大转速为40rpm。设备参数设定：在开始转棒实验前，设定实验参数，速度设定为40rpm/min，加速时间设定为60s，总实验时间设定为300s，用75%酒精擦拭转棒。实验数据采集：转棒实验需要测试4天，前三天为训练，第4天数据用于统计学分析。实验时将小鼠放在转棒上面，使小鼠背部朝向实验者，点击“开始”，记录小鼠在转棒上停留时间，每只小鼠每天测试三次，三次测试之间间隔5min，若小鼠测试过程中在转棒停留时间小于10s，则不记录此次实验数据，需要重新测试。每次测试后，需要用75%酒精擦拭转棒。通过转棒式疲劳仪对小鼠进行运动能力的评估。

高架十字迷宫实验

设备参数设定：在采集前，打开高架十字迷宫软件，开启摄像头与照明灯，点击“开场设置”，调整高架十字迷宫在摄像头正下方，设置开臂、闭臂以及中央区，设置采集时间为5min。采集之前，用75%酒精擦拭仪器。实验数据采集：将小鼠放在高架十字迷宫中央区，背部朝向实验者，之后拉上帘子，点击开始采集。待采集后，点击“识别轨迹”，并导出数据。

旷场实验

设备参数设定：在采集前，打开旷场软件，开启摄像头与照明灯，点击“开场设置”，调整旷场在摄像头正下方，设置目标区域，设置采集时间为15min。采集之前，用75%酒精擦拭旷场周围。实验数据采集：将小鼠放在旷场中央区，背部朝向实验者，之后拉上帘子，点击开始采集。待采集后，点击“识别轨迹”，并导出数据。使用旷场实验来评估小鼠的运动能力。系统分析出总活动路程(mm)、总持续活动时间(s)和不动时间(s)和速度（mm/s），这些指标反映了小鼠运动的能力。每次试验结束时都用70%的酒精清洁旷场箱，晾干后方进行下一次测试。

动物步态分析实验

设备参数设定：打开VisuGait步态分析软件，设定目标区域为23.3cm，小鼠需要在0.5至5s内通过目标区域。设置完成后，关闭照明灯，首先点击“Snap Background”，之后点击“Start”，从步态一端将小鼠放入，系统将开始记录步道中小鼠行走足迹，小鼠需成功三次在规定时间内通过步道内目标区域。一只小鼠数据采集结束后，需要用10%酒精擦拭步道，继续进行下一只小鼠的测试。

Fig2 Harmaline诱导的特发性震颤分析

注： B.腹腔注射Harmaline后Ucp4fl/fl、Pcp2cre;Ucp4fl/+与Pcp2cre;Ucp4fl/fl小鼠旷场中运动路程统计图；C.腹腔注射Harmaline后三种基因型小鼠旷场中运动平均速度统计图；D.腹腔注射Harmaline后Ucp4fl/fl、Pcp2cre;Ucp4fl/+与Pcp2cre;Ucp4fl/fl小鼠旷场中央区与边缘区路程之比统计图；E腹腔注射Harmaline后Ucp4fl/fl、Pcp2cre;Ucp4fl/+与Pcp2cre;Ucp4fl/fl小鼠旷场中央区与边缘区停留时间之比统计图。

爬杆实验

将一根长度50cm、直径1cm的杆子放入笼内，用不粘纱布包裹杆身便于抓取爬行，杆顶部有一个直径2cm的球形突起。小鼠头朝下放在杆子的顶端，从实验者释放动物开始计时，双前肢到达笼子底座时结束计时。每只动物测试三次，并计算平均时间（单位为s）。

抓力测试

使用大小鼠抓力测定仪进行神经肌肉强度测试，每只小鼠测试三次后取均值。让小鼠用前肢或前后肢抓住一根金属杆，轻拉着小鼠尾巴，小鼠松开抓在栅格上的爪子时抓力测定仪显示抓力数值(单位为g)。