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Nlrp3基因敲除小鼠与炎症性疾病

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2024-10-15 04:10

2021-07-09 11:31 点击次数：1333 关键词：

赛业生物《每周一鼠》栏目，每周五更新，为大家讲解一个小鼠模型的故事，希望对大家了解不同的疾病小鼠模型有所帮助。今天和大家见面的是Nlrp3基因编辑小鼠。

背景介绍

Nlrp3基因编码一个pyrin样蛋白，蛋白包含一个pyrin结构域，一个核苷酸结合位点(NBS)结构域和一个富亮氨酸重复序列(LRR)基序。该蛋白与凋亡相关的斑点样蛋白PYCARD/ASC相互作用，PYCARD/ASC包含一个caspase招募域，是NLRP3炎症小体复合体的成员。该复合物作为NF-kappaB信号的上游激活因子，并在炎症、免疫反应和细胞凋亡的调节中发挥作用。

图1. 炎症小体的分子机制示意图[1]

IL-1β，也称为内源性热原，是一种高度炎症细胞因子，其产生受到至少三个不同步骤的严格控制。第一步涉及pro-IL-1β蛋白（p35）的产生；随后裂解pro-IL-1β前体以产生活性 IL-1β 蛋白 (p17)，最后将 IL-1β 释放到细胞外环境中。中间步骤，即 pro-IL-1β 的加工，涉及激活 caspase-1 激活复合物，其最佳特征是炎症小体。NLRP3 炎症小体将无活性的 pro-caspase-1 加工成有活性的 Caspase-1，它将pro-IL-1β裂解为成熟的 IL-1β，导致炎症和细胞过早死亡。

编码 Cryopyrin 的基因NLRP3的显性遗传突变被证明是导致一系列炎症疾病的原因，包括家族性感冒自身炎症综合征 (FCAS)、Muckle -Wells 综合征 (MWS) 和新生儿多系统炎症性疾病 (NOMID) ，现在统称为冷热蛋白相关周期性综合征 (CAPS)。

Nlrp3基因编辑小鼠表型

1. 点突变模型

丙氨酸 352 到缬氨酸 (A352V) 和亮氨酸 353 到脯氨酸 (L353P) 的突变分别与经典 MWS 和 FCAS 患者密切相关，而在重叠综合征患者中则不太相关。通过ES打靶技术生成两个点突变小鼠模型：Nlrp3 A350V 和Nlrp3 L351P。因内含子中Neo的存在，阻断了基因的正常表达，通过交配不同启动子下表达Cre重组酶的小鼠介导Neo在不同部位删除并表达突变基因。

图2. Nlrp3 点突变小鼠打靶策略[3]

Nlrp3 A350V/+ / CreZ（胚胎期删除Neo并表达突变基因）幼崽在出生后 1-2 天或之前表现出炎症表型，在第 4 天出现皮肤脓肿，并出现鳞屑状红斑（图3A）。此外，这些小鼠在第 4 天表现出明显的生长延迟，缺乏色素沉着和毛发生长。Nlrp3 A350V/+ / CreL（骨髓细胞系删除Neo并表达突变基因)幼崽表现出相似的表型，但具有不同的死亡率动力学，因此这些小鼠中有 70% 存活到第 7-9 天，然后以增加的速度死亡。

图3. Nlrp3 点突变小鼠相关表型数据[3]

虽然与 MWS 患者中观察到的荨麻疹样病变不同，但在表达 A350V 的幼崽中观察到的皮肤红斑、脓肿和鳞屑表明存在潜在炎症。突变小鼠总体白细胞计数仅轻度升高，但中性粒细胞和血小板增多是明显的。在 CAPS 患者中一致描述了类似的血液学和皮肤检查结果。来自Nlrp3 A350V/+ / CreL幼崽的发炎皮肤切片进行了 IL-1β 和 IL-6 的免疫组织化学。两种细胞因子（主要在真皮中的 IL-1β 和表皮中的 IL-6）的表达增加，与来自 CAPS 患者的皮肤活检一致，并暗示这些细胞因子在皮肤病理学中的作用。TNFα 没有显着差异，这与先前描述的 CAPS 患者一致。

图4. Nlrp3 点突变小鼠血清和皮肤中多种细胞因子上调[3]

2. 敲除小鼠模型

通过ES打靶技术生成Nlrp3 （Cias1)敲除小鼠模型，通过在ATG起始位置处插入EGFP达到敲除的目的：

图5. Nlrp3基因敲除小鼠打靶策略[5]

野生型、Nlrp3+/-和Nlrp3-/-巨噬细胞产生相当数量的 pro-IL-1β，然而，与它们的野生型对应物不同，Nlrp3-/-巨噬细胞在 ATP 处理后没有切割 pro-IL-1β，表明，cryopyrin 对于 ATP 诱导的 caspase-1 激活至关重要；用 LPS或 Pam3CSK4 引发的野生型巨噬细胞响应尼日利亚菌素或 maitotoxin分泌IL-1β和IL-18，相比之下，Asc-/-和Nlrp3-/-巨噬细胞均未释放显着的IL-1β或IL-18。

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参考文献：

1. Stojanov S, Kastner DL. Familial autoinflammatory diseases: genetics, pathogenesis and treatment. Curr Opin Rheumatol. 2005 Sep;17(5):586-99. doi: 10.1097/bor.0000174210.78449.6b. PMID: 16093838.

2. Sutterwala FS, Ogura Y, Szczepanik M, Lara-Tejero M, Lichtenberger GS, Grant EP, Bertin J, Coyle AJ, Galán JE, Askenase PW, Flavell RA. Critical role for NALP3/CIAS1/Cryopyrin in innate and adaptive immunity through its regulation of caspase-1. Immunity. 2006 Mar;24(3):317-27. doi: 10.1016/j.immuni.2006.02.004. PMID: 16546100.

3. Kuemmerle-Deschner JB, Haug I. Canakinumab in patients with cryopyrin-associated periodic syndrome: an update for clinicians. Ther Adv Musculoskelet Dis. 2013 Dec;5(6):315-29. doi: 10.1177/1759720X13502629. PMID: 24294305; PMCID: PMC3836377.

4. Brydges SD, Mueller JL, McGeough MD, Pena CA, Misaghi A, Gandhi C, Putnam CD, Boyle DL, Firestein GS, Horner AA, Soroosh P, Watford WT, O'Shea JJ, Kastner DL, Hoffman HM. Inflammasome-mediated disease animal models reveal roles for innate but not adaptive immunity. Immunity. 2009 Jun 19;30(6):875-87. doi: 10.1016/j.immuni.2009.05.005. Epub 2009 Jun 4. PMID: 19501000; PMCID: PMC2759865.

5. Mariathasan S, Weiss DS, Newton K, McBride J, O'Rourke K, Roose-Girma M, Lee WP, Weinrauch Y, Monack DM, Dixit VM. Cryopyrin activates the inflammasome in response to toxins and ATP. Nature. 2006 Mar 9;440(7081):228-32. doi: 10.1038/nature04515. Epub 2006 Jan 11. PMID: 16407890.