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动物行为实验指南 ‖ 小鼠脑电/肌电信号采集在睡眠行为中的应用

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2024-10-20 05:04

一、实验介绍

脑电图 (Electroencephalogram，EEG) /肌电图 (Eectromyography，EMG) 是目前睡眠领域所接受的用来评估睡眠行为的最重要标准。德国精神科医生HansBerger在1929年发现，在人头皮记录的电势呈现正弦波的形式，其频率与测试人员的清醒水平直接相关，从而在睡眠觉醒的理解方面取得了迅速的进步。直到今天，脑电图与肌电图结合使用几乎囊括了所有的实验性和临床评估数据，将行为和生理学与包括人类在内的行为动物中的皮质神经元的活性相关联。其中，通过对获得的电信号数据进行模式和频谱分析（傅里叶变换），可以将睡眠分为非快动眼睡眠（NREM）和快动眼睡眠（REM）。

NREM睡眠的特征是快速而低振幅的脑电图随机眼运动和肌肉松驰。REM睡眠也被称为矛盾的睡眠，因为在这个阶段，大脑活动类似于觉醒状态，而大脑此时在很大程度上与外界断开了，并且似乎处于深度睡眠状态。对这一现象，很多研究推测之前觉醒阶段的记忆所产生的突出增强，会在REM睡眠阶段得到重复刺激，以此来避免睡眠过程中突触净缩减所造成的记忆的遗忘。相比之下，NREM睡眠期间虽然存在运动神经元的激活，但没有眼睛运动。人类NREM睡眠可以分为4个阶段，其中第4阶段被称为深度睡眠或慢波睡眠(Slow-wave sleep)，并通过脑电图在0.5-4 Hz之间的 δ 活动慢波来鉴定。大鼠和小鼠的NREM睡眠目前并没有详细的划分，这主要是因为它们没有长期的，类似于人类的固定睡眠时间。

对于睡眠的持续时间（数量）或睡眠强度（质量）的分析评判，则主要是根据脑电图 (EEG) / 肌电图 (EMG) 来进行。觉醒时长、NREM睡眠时长、REM睡眠时长、不同睡眠觉醒阶段的转换持续时长和频率更多的用来评价睡眠的数量需求和睡眠的稳定性。NREM睡眠开始及REM睡眠开始的延迟时长、睡眠后短暂觉醒和NREM睡眠阶段的 δ 活动更多的来评价睡眠的质量。

二、实验工具

红霉素软膏、聚维酮碘（碘伏）、3% 过氧化氢、生理盐水、林可霉素利多卡因凝胶、齿科树脂黏接剂。

螺丝刀、精细镊子、剪刀、缝合针线、气体麻醉剂，体视解剖显微镜和立体定位仪，EEG / EMG 底座、颅钉、EEG / EMG 记录系统和Sirenia® Sleep pro睡眠分析软件。

三、实验方法

EEG / EMG电极植入方法：

1.腹腔注射 (i.p.) 7% 水合氯醛麻醉小鼠。

2.在确认小鼠缺乏后脚掌按压疼痛之后，头颈部剪毛后碘伏消毒，再用乙醇清洁消毒。

3.将小鼠固定在立体定位注射仪上，并通过调节旋钮，使得小鼠脑袋基本平行。在小鼠眼睛上涂抹红霉素软膏，防止长时间照射影响小鼠视力。

4.使用眼科剪刀沿中线剪开头顶皮肤，将小鼠颅骨暴露出来，并将裸露的头骨用棉球蘸取3% 过氧化氢擦拭去除骨膜并清洁颅骨骨面，以方便头骨和牙科水泥的结合固定。

5.根据小鼠头骨的缝隙找到Bregma点，Lambda点，调平头骨。

6.用立体定位将电钻将其移至Lambda点，并将坐标设置为(0，0，0)，然后通过颅骨中的电钻钻四个孔。孔的坐标如下： (-1.27，0，0)，(-1.27，503，0)，(1.27，5.03，0) 和 (1.27，0，0)。

7.将EEG电极引脚植入颅下的硬脑膜，并将EMG电线插入颈部肌肉中，然后用牙科水泥将记录电极粘在头骨上。

8.麻醉恢复期间，将动物置于电热毯上，密切观察呼吸，若呼吸道分泌物过多可用吸痰管清理，直至麻醉苏醒，手术在无菌条件实施。术后连续注射3天青霉素，恢复一周开始适应睡眠记录系统。动物后恢复期间应定期抚摸动物减少应激反应。

EEG / EMG 数据采集方法：

1.小鼠术后恢复一周，期间密切观察小鼠伤口情况，若有渗出物应及时予碘消毒处理。恢复后的小鼠置于隔音、恒湿、恒温、通风良好、12h/12h自动明周期的睡眠记录室中。

2.将小鼠连至记录系统，适应2天，之后开始睡眠觉醒记录，按照实验需求进行一段时间的EEG / EMG信号记录。

3.基础睡眠记录结束后，可以人为对小鼠进行睡眠剥夺，药物注射等防止小鼠睡眠，再通过治疗给药研究待测药物对睡眠障碍模型小鼠的作用特点。

4.使用SleepyScore软件，将睡眠/唤醒状态分为20s NREM睡眠 (高振幅，1-4Hz的delta频率EEG和EMG信号紧张)，REM睡眠 (高振幅，6-9Hz的Theta频率EEG和EMG信号松弛)或者觉醒 (低振幅，快速的EEG和高振幅，可变的EMG信号)。然后合并计算，输出为每个小时的NREM睡眠，REM睡眠和觉醒时间及DeltaPower等。

四、测试指标的行为学意义

以10s为段解析睡眠觉醒时相，以1s为单位解析 EEG功率谱 (0-3Hz)。小鼠睡眠觉时相包括觉醒 ( wakefulness，W) ，NREM和REM睡眠。

W 时相的EEG特征为低幅快波 (主要为14.5-60Hz的gamma和beta波)，伴显著肌电活动，以额-顶叶引导出低幅快波脑电和明显的肌电活动为特征；

NREM 睡眠以睡眠梭形波和高幅慢波为特征，肌电活动明显减少，EEG主要为0.5-4Hz的delta波，有时夹杂9-14Hz的alpha波；

REM 睡眠以低幅快波为特征，除偶尔有肌肉抽动外，无明显肌电活动，EEG以4.5-8.5Hz的theta波为主，EMG活动消失。

五、数据统计

使用睡眠分析软件 Sirenia®Sleep pro 对 EEG 和 EMG 信号进行分析，使用GraphPad Prism进行数据的统计。

六、注意事项

①尽量选择戊巴比妥钠等药效稳定的麻醉药麻醉小鼠。水合氯醛不能减轻小鼠疼痛，违反动物伦理学；异氟烷气麻易引起小鼠呼吸急促甚至死亡，增加手术失败率。

②立体定位过程，中耳杆需准确插入小鼠耳洞中，深度一般为左右各6mm，太深易致死；颅骨表面尽量调平，否则会影响 EEG / EMG 底座的放置，进而影响信号的采集。

③为保证EEG 记录准确性，植入的底座前边缘位置应在前囟前侧 3.0～3.5 mm 处，该条件下所有螺钉会更牢固地固定在小鼠颅骨上。

④使用新的 8245-23 型注射针对颅骨打孔，动作轻柔地将针刺入颅骨，切忌打孔过深导致大出血或影响颅钉的埋植。

⑤颅钉植入一半时需将导电胶滴在螺纹处，拧紧颅钉。为防止底座脱落，牙科水泥需紧密包裹住底座且不要接触小鼠皮肤。

⑥用精细镊将 EMG 肌电丝置入颈部肌肉中并缝合。不可植过浅导致肌电丝中途滑出。

七、心得经验

小鼠 EEG / EMG 信号采集技术既有优点也有其不足。

一方面，因为EEG是对大脑神经活动进行直接和实时测量，所以它可能要求特定的神经生理通路、意识/睡眠状态以及大脑功能的精确时间动态(dys)的完整性。此外，当这种精细的时间分辨率与估计潜在来源相结合时，就可以描述大脑网络、它们的连通性，以及特定活动在给定函数的过程中被认为是串行还是并行的程度。

另一方面，由于EEG是对电位进行测量，这对通过使用EEG来充分分析和解释活跃点与参考点的测量结果十分重要。然而，由于产生脑电图的神经活动在整个大脑中传导，这意味着人们不能假定记录在头皮上某一点的信号的源头就在正下方，无法精确到研究某一个脑区的电活动对睡眠的影响。

目前小鼠皮层脑电多导睡眠监测系统发展迅速，不仅有传统的有线脑电监测，无线记录系统也逐渐得到广泛应用。无线EEG / EMG系统利用轻巧的无线稳压器装置，在动物头部即可完成脑电图和肌电信号的数字化处理，并通过蓝牙技术传输至电脑采集软件进行处理分析。消除了传统有线式设备对于动物活动的限制，使动物更加接近于自由活动的生理状态，因而采集的数据精确度更高。相对于传统脑电图遥测设备，无线 EEG / EMG系统具有信号接收范围广且干扰小等特点。