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动物行为与光电专题㉗丨光纤记录小鼠急性痫性发作

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2024-10-30 17:10

实验步骤

①将加热垫放在脑立体定位仪的底板上并打开加热垫电源，使加热垫在整个手术过程中保持在38±1℃以维持小鼠体温。小鼠称重后放入自制的诱导盒中诱导麻醉，异氟烷与99.9%氧气的混合气体通入诱导盒中大约5~8min，此时控制异氟烷浓度为2%~2.5%。小鼠诱麻过程中用75%酒精对手术器械进行消毒。待小鼠不再运动后将麻醉气体改通入脑立体定位仪的麻醉面罩，并迅速将小鼠从诱导盒中取出放置在加热垫上，使小鼠上门齿勾在麻醉面罩中的卡槽内。确保小鼠眨眼反射消失、夹尾的痛觉反应消失后，将麻醉浓度调至维持浓度1.5%，在手术过程中随时根据小鼠的呼吸情况判断其麻醉程度，并据此适当调节麻醉浓度。例如，若小鼠出现深大呼吸表明其麻醉程度较重，可调低麻醉浓度至1.2%左右。接下来在小鼠眼部涂抹红霉素眼膏，避免其眼睛在手术过程中被强光灼伤并保持小鼠眼部湿润。之后打开冷光源，进行小鼠头部的固定。拧紧麻醉面罩上的鼻夹固定小鼠上颌，随后将定位仪两侧的耳杆缓慢地深入小鼠的外耳道，待耳杆接触到外耳道中稍靠前方的颅骨后轻轻调整高度和力度，并先后拧紧固定耳杆的螺丝，使小鼠头部在肉眼观察下鼻对正中、左右对称。检查固定的松紧程度，标准为头部不动、提尾不掉，但固定得过紧有可能压迫小鼠迷走神经而造成术中呼吸困难甚至降低手术成功率。

②沾湿小鼠头顶部毛发后用剪刀剪去其眼部向后至颈部前的毛发，用碘伏消毒暴露的皮肤。用镊子轻轻夹起小鼠头顶部头皮并将注射器针头水平推入其头皮正中下方，局部注射0.2mL利多卡因，一方面尽可能减轻痛感，另一方面使筋膜膨胀便于清理。随后用镊子和剪刀配合，剪去小鼠两眼后至两耳前大约1cm2大小的头皮，充分暴露颅骨。用剪刀清理残留在颅骨上以及手术创口边缘的筋膜，并用棉球蘸取生理盐水反复擦洗，直至清晰暴露骨缝。筋膜应尽可能清洗干净，否则可能影响之后牙科水泥的固定。将夹持器上的玻璃电极移至目的坐标后进行标记，随后用牙科钻围绕标记点轻轻磨出一直径0.5~1mm的环形颅窗，过程中可用吸耳球吹去颅骨粉末后滴加生理盐水，以便观察开窗位置下方的血管。此外，为避免牙科钻转动造成热损伤，环形区域颅骨磨薄的过程可在生理盐水水下进行。当用镊子轻轻按压环形中央的颅骨观察到其可随镊子一起上下晃动时，将一次性注射器的针头弯成钩状，避开血管，挑去环形颅窗中央的颅骨片，暴露脑组织。

③套管的植入与固定用于颅内微量给药的套管系统包括导管、导管帽、注射内管、锁紧螺帽和聚乙烯（Polyethylene，PE）管，手术过程中需要将导管的不锈钢细管植入目标脑区，导管帽用于在动物清醒时插入导管并通过螺纹与导管固定，起到密封的作用。将小鼠连同加热垫一同放入鼠笼中，待小鼠恢复清醒后撤掉加热垫。术后的小鼠单笼饲养于原动物房中。

④KA或生理盐水的颅内给药术后恢复3~5天的小鼠用于进一步颅内给药的实验。首先准备安装套管系统：注射内管顶端与PE管相连，PE管另一端套入锁紧螺帽后连接微量进样针的针头，用封口膜缠紧两端相接处。将矿物油用1mL注射器由微量进样针的活塞端推入系统，排出微量进样针、PE管以及注射内管中的空气后，将微量进样针固定在微量注射泵上。小鼠由动物房拿至实验室适应30min后进行异氟烷气体麻醉。用微量注射泵由注射内管尾端倒吸入1μl浓度为2mM的KA注射液，由于该KA注射液中含有快绿，且与矿物油间存在分层液面，因此可通过肉眼观察液面的移动而判断是否顺利吸入/排出KA注射液。随后拧下导管帽，将注射内管尾端小心插入导管后拧紧锁紧螺帽。撤下麻醉面罩，等待小鼠恢复清醒。

行为学观察

用一直径30cm、高50cm的直筒状透明玻璃缸作为观察癫痫样小鼠行为的装置，该装置即便与在各个方向观察小鼠的行为特点，又可以避免在小鼠表现出窜跳等剧烈的癫痫样活动时难以控制。将完全清醒的小鼠放入行为学装置30min后，用微量注射泵以30nl/min的速度向小鼠脑中HPC-CA3区推入0.5μl浓度为2mM的KA注射液，完成颅内给药。除将KA注射液替换为生理盐水外，对照组小鼠的处理方法与KA组均相同；

KA的皮下注射称量小鼠体重后，按15mg/kg或20mg/kg的剂量在1mL注射器中吸取KA注射液。将小鼠放在鼠笼笼盖上，左手提起小鼠颈背部皮肤，右手持注射器并使针尖平面朝上、平行地扎入皮内，注射药品。皮下鼓起小包表明皮下注射操作成功；

行为学观察与评价标准

观察小鼠给药前30min和给药后2h内的行为学变化。每只动物观察前均用75%酒精擦拭行为学装置内部并充分晾干，使动物之间不因气味产生干扰。在行为学装置外摆放好高清摄像头，调整摄像头拍摄视野后对小鼠给药前、后的行为表现进行摄录。

数据分析

实验结束后对每组各只小鼠的行为学视频进行分析，根据改进的Racine分级法对小鼠痫性发作的严重程度进行分级：0级-正常行为；Ⅰ级-失神样的呆滞；Ⅱ级-耸肩，伴随面部、前肢的自动样动作；Ⅲ级-直立，伴随持续的面部或前肢的自动样动作，以及持续的前肢阵挛；Ⅳ级-反复地直立和跌倒，伴随双侧前肢阵挛；Ⅴ级-侧卧且伴随强直阵挛性抽搐，或伴随抽搐的窜跳与胡乱跑动。小鼠出现了Ⅰ级及其以上等级的发作即认为是被诱发了痫性发作，同时将第Ⅰ、Ⅱ级称为非抽搐性发作，Ⅲ级及其以上发作称为抽搐性运动发作（CMS）。统计各组小鼠在给药后2h内达到CMS和达到Ⅴ级发作的比例；统计各组每只小鼠达到CMS的发作次数和每次CMS的发作时长。

KA诱发的CMS的平均发作次数

参考文献：

1、Tada M, Takeuchi A, Hashizume M, et al. A highly sensitive fluorescent indicator dye for calcium imaging of neural activity in vitro and in vivo [J]. Eur J Neurosci,2014,39(11):1720-8.

2、Jares-Erijman EA and Jovin TM. FRET imaging [J]. Nat Biotechnol,2003,21(11):1387-95.

3、Nagai T, Yamada S, Tominaga T, et al. Expanded dynamic range of fluorescent indicators for Ca(2+) by circularly permuted yellow fluorescent proteins [J]. Proc Natl Acad Sci U S A,2004,101(29):10554-9.

4、Wallace DJ, Meyer zum Alten Borgloh S, Astori S, et al. Single-spike detection in vitro and in vivo with a genetic Ca2+ sensor [J]. Nat Methods,2008,5(9):797-804.

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