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脑声常谈丨啮齿动物慢性温和不可预测应激模型建立及行为学评价

萌宠菠菠乐园
2024-10-31 19:37

慢性不可预见的温和刺激（简称CUMS）模型通过模拟人类生活中的不良应激事件，来诱发动物的抑郁症状，这种模型的病理生理机制更加接近人类抑郁症的真实发病过程，因此是一个经典的抑郁症动物模型。CUMS模型考虑到了人类社会生活和环境等多种复杂因素的影响，能够较为真实地反映重度抑郁症的病理过程和发展，因此经常被用于研究重度抑郁症的发病机制。

造模鼠连续28d暴露于不可预测的温和应激中，每天随机两种不同的应激方式，主要的应激因子包括通宵照明、夹尾、湿笼、拥挤、冰水游泳、禁水禁食等。针对动物CUMS模型，采用简便的应激因子如通宵照明、夹尾和湿笼等进行模型的建立，造模后使用禁水20h，测试24h的糖水偏好实验进行测试。

Fig1 慢性不可预知温和刺激范式示例

(B)湿垫料：向1升锯末垫料中倒入300毫升水混合均匀。(C)睡眠剥夺：在笼子的食物/水相对的一侧，放置一个圆柱形木制底座（直径6厘米，高5厘米），笼底填充3厘米深的自来水，使动物只能站立在底座上，不能躺下睡觉。(D)电足电击：把大鼠放在一个UgoBasile自动反射调节器内（尺寸为40cm长×20cm宽×22cm高），通过网格地板给予0.8mA的电击。(F)笼子倾斜：将笼子倾斜45度，食物和水放在较高的顶部位置。(G)缺水。(F)食物匮乏。(H)圈养：大鼠被单独饲养在一个小笼子里（尺寸为20厘米长×10厘米宽×13厘米高）。为了减少压力源的可预测性，各种压力条件以半随机的顺序施加。除了每次持续10分钟的电足电击，其他压力条件均持续22小时。在整个实验方案中，动物将多次经历每种压力条件，次数在3至4次之间。

大鼠慢性不可预期性应激程序

实验人员会随机选取每天对CUMS组的大鼠施加两种应激刺激，共有十种不同的刺激方式。这些包括：足底电击（1.0mA，每次电击5秒，间隔10至60秒，共计60次）；冷水强迫游泳（水深超过30cm，水温为4°C，每只大鼠5分钟）；悬尾（每只大鼠10分钟）；昼夜颠倒；束缚应激（每只大鼠2小时）；倾斜鼠笼（45度倾斜）；拥挤（持续24小时）；夹尾（每只大鼠10分钟）；潮湿垫料；频闪灯刺激（180次/分钟，持续12小时）。为了评估动物的抑郁状态，所有实验大鼠在应激程序开始前及应激结束后第二天会进行糖水偏好测试。这九种刺激在四周内随机进行，每天只施加一种刺激，并且为了确保动物无法预测刺激的出现，不连续施加同一种刺激。实验组大鼠单独饲养，而对照组则正常饲养。

小鼠慢性不可预期性应激程序

1、在实验开始之前，所有动物均在室内条件下分笼饲养，保持约25℃的室温和12小时昼夜节律，自由进食和饮水。所有动物均获得无菌的饲料和清洁的饮用水。在适应期1至2周后，动物随机分组，并进行初步测试，记录如体重、糖水偏好测试的百分比等基线数据。此外，将剔除那些在基线数据上有显著差异的动物。

2、每天会随机对模型组动物施加1至2种刺激条件，持续四周时间，施加的刺激是无规律的。

3、刺激因子包括：45度倾斜鼠笼7h、禁水24h，禁食24h，噪声（>80dB）3h，潮湿垫料24h，冰水游泳5min，灯光昼夜颠倒12h，合笼饲养24h（6只一笼），足底电击1min；

应用刺激说明：

45度倾斜鼠笼：7h，将鼠笼与水平面倾斜45度角放置；

禁水：24h，剥夺饮水；

禁食：24h，剥夺饮食；

噪声：3h，高中音量，类似蛇音（>80dB）；

潮湿垫料：24h，向鼠笼中倒入清水,使垫料湿润,以水位漫过垫料表面为度,维持浸湿状态24h，24h后更换清洁垫料；

冰水游泳：5min，将受试动物放入温度调至4℃的水中，受试动物的脚尖刚好能触及到桶底，5min后将动物取出。

灯光昼夜颠倒：12h，天黑开灯照明；

合笼饲养：24h，6只一笼，正常单独但笼饲养；

足底电击：1min，受试动物置于电击箱，持续1min。

4、造模结束进行行为学测量(糖水实验、旷场实验、悬尾实验等)，验证模型。

行为学评估实验

糖水偏好实验（Sucrose preference test）

快感缺失是抑郁症的主要症状之一，通过糖水偏好测试、条件性位置偏好测试和自我给药等行为测试模型来检测。糖水偏好测试用来评估抑郁症的核心症状——快感缺失。该测试通过测量动物在水剥夺后2小时内对糖水和自来水的消费量，计算相对糖水消耗量（糖水消耗量除以体重后乘以100g）以及糖水偏好百分比（糖水消耗量占总液体消耗量的百分比），并取三次测试的平均值作为糖水测试的基础值。

具体步骤：

所有动物受训饮用1%的蔗糖水,开始48ｈ内，将训练受试动物适应含糖饮水，将受试动物暴露于1瓶为１％的蔗糖溶液，另一瓶为清水；

在禁水禁食20小时后，给每只受试动物提供两瓶定量的水：一瓶1%的蔗糖水和一瓶清水，让动物饮水1小时。通过称量饮水瓶的重量来计算相对糖水消耗量（糖水消耗量除以体重后乘以100%）以及糖水偏好百分比（糖水消耗量占总液体消耗量的百分比），并取三次测试的平均值作为糖水测试的基础值。

记录每只大鼠在测试期间的水和糖水消耗量，从而计算糖水偏好指数（糖水消耗量占总液体消耗量的比例）。糖水消耗量或偏好指数的下降表明动物出现了快感缺失的状态。

注意定势转移任务测试（AST）

过程简述如下：应激结束前第5天，开始对大鼠实施一周的限食，每日14克。第7天，进行五阶段任务测试，包括简单辨别（Simple Discrimination，SD）、复杂辨别（Compound Discrimination，CD）、内维度转换（Intra-Dimensional shift，IDS）、逆反学习（Reversal Learning，REL）和外维度转换（Extra-Dimensional shift，EDS）。每个阶段都包含来自不同感官维度（如嗅觉、视觉、触觉等）的线索对，其中与奖励物关联的线索为正性线索，被视为关键维度。大鼠需学会根据关键维度中的正性线索定位奖励物。各任务阶段依次进行，每个阶段只有在动物连续6次反应正确后，才能进入下一个阶段。记录的数据为每个阶段达到标准所需的训练次数。

旷场实验

旷场实验箱内部尺寸为100厘米长、100厘米宽和40厘米高，测试间设有视频录像设备和照明设施。将大鼠放置在敞箱的中央区域，利用VisuTrack动物行为分析系统（由上海欣软公司提供）自动记录大鼠在5分钟内的运动路程、活动次数、静止时间、中央区域的活动路程以及平均速度等数据。实验的进行时间定在上午8:00至12:00之间。

- 大小鼠旷场实验箱，型号：XR-XZ301，上海欣软 -

奖励驱动的探索性测试

将每个实验组（非CUMS/溶媒、非CUMS/抗抑郁药、CUMS/溶媒和CUMS/抗抑郁药；每组16只小鼠）分为两个亚组：接受饼干的小鼠和接受常规食物颗粒的小鼠（每组8只小鼠）。亚组大小不应小于八只小鼠。

评估开始前四个半周，连续2.5周，每2天在“饼干亚组”每只小鼠的笼子里放一块饼干（约2g），以使动物熟悉可口的刺激。考试前的最后两周不允许使用cookie。

在测试开始前一小时，移除所有笼中食物。这样做是为了消除由于饥饿引起的个体之间进食动力的差异。如果不采取此措施，部分小鼠可能会不愿意进食，从而可能导致测试结果出现偏差。尽管完全剥夺食物可能对小鼠的健康不利，但鉴于本次测试中食用的饼干片含糖量及其食用频率，不太可能对小鼠造成任何有害影响。

将一块饼干（2厘米×2厘米）或普通食物颗粒放在黑色室的中心，然后将鼠标放在白色室中设备的另一端（头部面向开口的对面）。观察是在低强度白光（∼200lux）下进行的。

在5分钟的测试过程中，测量小鼠通过第一道门和第二道门（当其四条腿跨过门时）探测食物并咀嚼食物所需的时间（延迟）以及数量，小鼠有时会探测并咀嚼食物。小鼠通过第一道门后，立即关闭门。如果2分钟后小鼠未能进入灰色房间，可轻轻推动其进入第二个房间并关闭门，但不关闭第二道门。

第一个trial结束后，将鼠标放回其家笼中。每只小鼠之间用70%酒精清洁设备。

每3天对每只动物进行一次测试（即9天内进行四次测试）。

Fig2 奖励驱动的探索性测试

筑巢测试

1、由于应激原因，小鼠已被单独饲养，因此在实验前将非CUMS小鼠隔离于单独的干净笼子中24小时。与需要将动物分为多组进行奖励驱动探索性测试的方法不同，此次筑巢测试无需如此复杂分组。实验分为四组进行：非CUMS/溶媒组、非CUMS/抗抑郁药组、CUMS/溶媒组和CUMS/抗抑郁药组，每组16只小鼠。

2、在活跃期的黑暗阶段开始前一小时，每个笼子中都放置一块棉花用于筑巢。为了不影响小鼠的自然筑巢行为，应避免在24小时的测试期间使用任何药物或测试剂。

3、在两个时间点（光照阶段开始后5小时和23小时），使用以下标准评估巢质量：

1分：棉方块完好。

2分：棉方格被部分使用。

3分：棉花散乱，但无巢状。

4分：棉花已聚集，但没有巢（“平巢”）。

5分：棉花聚集成一个“球”，有一个供动物进入的小通道（如冰屋；有或没有屋顶）。对巢质量的第二次评估在黑暗阶段开始前1小时进行，以避免在小鼠苏醒期间破坏巢。

Fig3 筑巢测试中的筑巢示例

(A)1分：小鼠没有使用棉巢，棉巢完好无损。(B)得分2：小鼠部分使用了棉巢。(C)3分：小鼠散落棉花，但没有巢。(D)得分4：小鼠聚集棉花形成一个扁平的巢。(E)得分5：小鼠聚集棉花形成一个“舒适”的巢，有墙壁和一个小入口。对于不完全满足评分标准的巢，可以给予中间评分。在这些图片中，小鼠被标记了苦味酸。

梳理行为测试

1、将小鼠单独放入“喷雾”笼中。由于非CUMS小鼠在进行筑巢测试前已被隔离至少24小时，故此步骤中每只动物均单独饲养。对四个实验组（非CUMS/溶媒、非CUMS/抗抑郁药、CUMS/溶媒和CUMS/抗抑郁药；每组16只小鼠）进行梳理测试。

2、用高粘度10%蔗糖溶液喷洒小鼠背部以刺激梳理行为，并快速将小鼠放回其家笼中。喷雾器可以输送固定体积（∼0.7ml）的蔗糖溶液。每只小鼠应接受两次喷雾。

4、测量小鼠启动首次梳理行为的延迟时间以及在5分钟内梳理行为的频率和持续时间。当小鼠回到其家笼后，立即在喷涂蔗糖溶液后启动秒表。此评估在红光照明下进行，并且在单一家笼的原始架子中完成。

高架十字迷宫实验

该实验利用大鼠对新环境的探究特性和对高悬敞开臂的恐惧，形成矛盾冲突，评价动物是否处于抑郁焦虑状态。

高架十字迷宫，型号：XR-XG201

强迫游泳实验

在观察 CUMS 模型鼠进行强迫游泳测试时，记录其静止时间（除了必要的动作以保持鼻子在水面上外，无其他动作）、挣扎时间（前爪剧烈运动）和游泳时间（前后爪有规律地上下划动），以此来评估模型鼠的绝望程度。

注意事项

1、随机给予刺激，连续两次刺激不能相同，使受试动物不能预料刺激的发生；

2、①糖水测试次数要少，以免形成记忆；②糖水基础值大的大鼠比较容易受应激的影响而成模；③由于应激使大鼠体质量下降的较多，在做实验时最好选择体质量大一点的大鼠进行实验。

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