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光遗传学联合纳米材料硫化铜在癫痫治疗中的应用进展

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2024-11-02 10:55

本文原载于《中华神经外科杂志》2017年第2期

癫痫是一组以中枢神经系统神经元细胞群过度异常放电而引起的慢性、阵发性的脑功能障碍。目前约有1%的世界人口受癫痫发作的影响，其中癫痫在国外的患病率约为5‰～7‰，在我国约为0.33%～0.58%[1]。虽然早期可以应用抗癫痫药物对其进行有效的治疗，但仍有超过20%的患者对药物产生顽固的耐药性，最终发展为难治性癫痫。近年来，一种新兴技术"光遗传学"逐渐应用于癫痫的治疗研究领域。该技术是基于光学和遗传学相结合，通过构建光敏蛋白基因载体并表达于特定的神经元区域，利用不同波长的外源光照射来精准地兴奋或抑制神经元活动[2]。光遗传学技术应用于癫痫的研究在近期取得了重大成果。研究者利用该技术可对癫痫动物模型中特定的神经元区域进行靶向调控，并且该技术具有高效的时间和空间精确性等优势，有效地控制了癫痫的发作[3]。然而，光遗传学技术目前仍然采用病毒作为载体进行光敏蛋白基因表达载体的构建。由于病毒载体具有内在的毒性、免疫原性以及潜在的致瘤性等缺陷，因而有一定的生物安全风险[4]。为此，有必要开发一种新型载体作为光敏蛋白基因的靶向传递工具。纳米材料硫化铜由于具有制备工艺简单、极佳的光热稳定性以及良好的生物相容性等优势，可以高效透过血脑屏障，并靶向地富集于肿瘤细胞而对周围正常组织细胞有较低的毒副作用，近年来将其作为纳米光热试剂应用于生物医学研究领域已成为当今热点[5]。此外，研究者对硫化铜进行加工修饰和改良，制备出一种新型纳米载体广泛应用于生物医学领域[6]。本文首先对于癫痫的发病机制进行概述，同时对于新兴领域光遗传学技术和光热治疗技术分别在癫痫、肿瘤诊治方面的研究应用予以介绍，并对纳米材料硫化铜作为新型载体基于光热疗法联合应用于癫痫的治疗研究进行探讨和展望。

一、癫痫的发病机制

目前针对于癫痫发病机制的研究主要集中于分子生物学领域和离子通道领域。中枢神经系统的电活动主要是由兴奋性中间神经元和抑制性中间神经元突触间神经递质的传递来介导，通过兴奋性神经递质和抑制性神经递质的释放与吸收，保持中枢神经系统的电活动处于相对稳定的状态。然而，兴奋性中间神经元活动的增强或抑制性中间神经元活动的减弱均可影响神经元环路水平的调节，引起异常放电，从而诱发癫痫[7]。其中，兴奋性神经递质谷氨酸和抑制性神经递质γ--氨基丁酸(GABA)与癫痫的发作密切相关。有关研究表明，GABA通过与相应的受体相结合使神经元细胞膜的Cl－通道开放，大量Cl－内流，细胞内膜电位增加而产生超级化反应，形成抑制性突触后电位，从而抑制神经元放电[8]。因此，Cl－通道的变异和GABA及其相应受体功能丧失均可引起神经元环路的异常兴奋，从而导致癫痫的发生[9]。

谷氨酸是中枢神经系统重要的兴奋性神经递质，可通过激活NMDA受体刺激细胞外Ca2＋大量内流，使细胞发生缓慢而持久的去极化，突触过度兴奋，从而引发一系列级联反应导致癫痫发生[10]。同时，在癫痫患者和癫痫动物模型的研究中，均发现谷氨酸水平升高[11]。

目前，有关Na＋通道与K＋通道在癫痫发病机制中作用的研究报道较多。中枢神经系统的Na＋和K＋共同参与介导神经元细胞的去极化和复极化过程，维持动作电位的发生和静息电位的形成[12,13]。各种原因所致的基因突变可导致相应编码的离子通道蛋白的结构和功能发生异常，影响Na＋和K＋的梯度运输，从而诱发神经元异常放电，直接导致癫痫的形成[14,15,16]。这些研究表明，无论是神经递质的功能和结构改变抑或离子通道的变异，均可引起中枢神经系统神经元的异常放电，最终导致癫痫发作。

二、光遗传学技术原理

光遗传学是近年来将光学与重组DNA技术相结合的一种神经生物学研究技术方法，其原理是将光敏感的离子通道蛋白通过重组DNA技术表达在相应的靶细胞或靶器官上，形成转基因蛋白。根据表达后光敏蛋白的吸光系数不同，利用不同波长的外源光照射并激活光敏蛋白，引起蛋白构象发生改变，使其调控的离子通道开放，从而实现对细胞、组织、器官及其生理功能的精准调控[2]。光遗传学在神经生物学领域的应用研究主要包括3个步骤：选择表达发挥特定作用的光敏蛋白基因；构建表达载体并扩增，检测其表达情况；光源照射并记录影像[17]。

光遗传学技术在神经功能控制领域的应用主要基于2种光敏蛋白：ChR2和NpHR。ChR2是一类7次跨膜光敏感阳离子通道蛋白，也是一类兴奋性光敏蛋白，其活化光谱范围是350～550 nm，中心波长为470 nm。表达ChR2的靶细胞在波长为473 nm的蓝光照射下，ChR2通道被激活开放，阳离子(Na＋、Ca2＋、K＋等)进入细胞内，使细胞产生一系列去极化反应，产生动作电位[18,19]。NpHR是一类7次跨膜螺旋结构的光敏感Cl－通道蛋白，其活化光谱范围为525～650 nm，中心波长为578 nm。表达NpHR的靶细胞在黄光照射下，NpHR Cl－泵被激活，Cl－由细胞外进入细胞内，使细胞产生超极化反应，从而抑制细胞的生物学功能[20]。

光遗传学技术在神经生物学领域应用中，不仅要选择特定的光敏蛋白，还需将光敏蛋白高表达于特定的靶细胞或靶器官中，并建立精准的外源光照射，发挥特定的生物学效应。其中，病毒转运是最常用的转运方式，目前主要应用腺相关病毒和慢病毒，其病毒表达系统可以高水平表达光敏蛋白。另一种是转基因动物，运用重组DNA技术将特定的光敏蛋白基因敲入动物DNA中，在启动子的作用下，表达并合成光敏蛋白[21]。

三、光遗传学技术在癫痫研究中的应用

通过近几年在癫痫治疗中的研究表明，光遗传学技术可以靶向地对分子、离子通道以及信号传导通路进行调控，有效地控制癫痫发作，实现对癫痫的精准治疗。这些研究应用已取得了突破性的进展，为癫痫的治疗开辟了新的研究领域。Tønnesen等[22]在2009年首次将光遗传学技术应用于癫痫的治疗，采用海马脑片在体外培养大鼠癫痫模型，通过构建LV-NpHR-EYFP(增强型黄色荧光蛋白)-pCaMKⅡ矢量控制结构，在CaMKⅡα启动子作用下，成功地将NpHR表达在海马锥体细胞和颗粒细胞上，然后采用波长为573～613 nm的体外黄光照射，有效地抑制了动作电位去极化，从而明显减弱癫痫样放电。随后Sukhotinsky等[23]用光遗传学方法，制备氯化锂——匹罗卡品癫痫大鼠模型以模拟急性癫痫发作来测试海马锥体兴奋性神经元的作用，利用重组腺相关病毒携带eNpHR3.0基因和荧光标记的蛋白质(黄色荧光蛋白，YFP)基因与CaMKⅡα组成CaMKⅡα-eNpHR 3.0-eYFP重组载体，通过CaMKⅡ启动子的作用，将eNpHR 3.0表达于海马锥体神经元，运用外源光照射，显著地抑制了癫痫的形成和传播。

以上研究均运用抑制性光敏蛋白NpHR及其衍生蛋白作用于中枢神经系统兴奋性中间神经元，降低异常神经元的兴奋性。而利用兴奋性光敏蛋白ChR2表达于抑制性神经元细胞群，癫痫发作也同样可以被抑制。Selvaraj等[24]提出一种利用开环光遗传学来控制人类大脑皮质神经元细胞中痫样活动的模型，模拟癫痫样放电的起源和传播。当抑制性神经元细胞群体中表达的ChR2被外源光激活时，大脑皮质神经元病理性同步放电中断，从而成功地抑制了癫痫发作。Chiang等[25]通过Thy1启动子的作用将ChR2表达于大鼠海马CA3区GABA能神经元表面，进行体内实验和体外实验时均采用外源蓝光照射，对痫样活动的抑制程度分别可达70.0%和82.4%。

目前的研究表明，光遗传学技术在动物癫痫模型应用中已成为较成熟的技术手段，然而将其应用于临床癫痫的治疗研究中仍有诸多问题需要解决。随着研究的深入，光遗传学将会在未来的临床探索中有着十分广阔的前景[26]。

四、纳米材料硫化铜在生物医学领域中的应用

纳米材料硫化铜由于具有良好的性能优势，已经广泛应用于生物医学领域中，如细胞荧光成像、DNA检测、葡萄糖代谢物的检测、食源性致病菌的检测等[27]。

近几年，纳米材料硫化铜作为光热疗法一种新型的光热剂，由于具有低毒性和高效的近红外光吸收功能，以及在光热转换中几乎不受颗粒的大小、形状和周围介质的影响等优点被广泛应用于肿瘤的治疗领域中[5]。光热疗法是指将纳米材料作为光热剂，利用其光热转换效率和生物相容性的优势，增加肿瘤细胞对纳米材料的摄取，在外源激光照射下，将光能转化为热能，利用高温使细胞膜松动，改变细胞膜的通透性。此外，高温还可造成DNA双链的断裂和蛋白质变性，导致细胞发生不可逆的损伤，并最终摧毁肿瘤组织[28]。为了提高纳米材料硫化铜的靶向转染效率，Huang等[29]制备出超小尺寸的疏水硫化铜纳米颗粒(CuS NPS)，通过涂层将DSPE-PEG2000修饰到CuS NPS表面上合成CuS@DSPE-PEG NPS新型纳米材料。该材料具有良好的水溶性、显著的稳定性以及生物相容性。通过对小鼠静脉注射，CuS@DSPE-PEG NPS可以靶向转移到肿瘤细胞或组织，在808 nm近红外激光照射下具有高效的光热转换效率，发挥光热治疗。

虽然近红外光具有良好的穿透能力，然而，随着穿透组织深度的增加，近红外光会发生散射并且逐渐被组织吸收，导致其能量逐渐降低。因此，单独的光热治疗难以根除深部的肿瘤组织[30]。近年来，研究者通过化学、物理等方法对纳米材料硫化铜进行加工修饰和改良，形成新型纳米载体与免疫疗法、化疗药物、基因疗法相结合应用于肿瘤的联合治疗。

在肿瘤的治疗中，光热疗法主要应用于治疗原发肿瘤的研究，还不能对转移性肿瘤进行有效的控制。为此，Guo等[31]研发了壳聚糖涂层空心硫化铜纳米粒子(HCuSNPS)作为纳米载体组装寡核苷酸含胞嘧啶鸟嘌呤(CpG)的免疫佐剂合成高分子配合物，将"光热免疫联合疗法"应用于小鼠乳腺癌细胞模型中，在近红外激光照射下，高分子配合物结构分解，释放出的CuS利用光热效应诱导肿瘤细胞的死亡。同时，裂解出的免疫佐剂释放到肿瘤周围组织，引发特异性抗肿瘤免疫，清除残留的肿瘤抗原，有效地控制了转移性肿瘤的发生和发展。

Bi等[32]设计一种新型的纳米载体将"光热化学药物联合疗法"应用于肿瘤的治疗中，将化疗药物盐酸阿霉素(DOX)共轭到超小尺寸的CuS NPS上，形成新型硫化铜纳米颗粒(CuS-DOX NPS)，靶向地将化疗药物运输到肿瘤组织中，在808 nm近红外激光照射下，DOX从CuS-DOX NPS中释放，高效地发挥化疗药物的抗肿瘤效应。

最近，Kim等[6]提出将无机纳米材料作为基因载体应用于肿瘤的靶向治疗，该团队开发了一种金纳米簇，通过将金纳米壳共轭到腺病毒的赖氨酸残基上，形成新型纳米载体，同时将编码荧光素酶的基因整合到新型纳米载体并导入肿瘤细胞，通过显像技术成功地检测到荧光素酶基因的表达。

五、光遗传学联合纳米材料硫化铜应用于癫痫治疗的探索与展望

如前所述，光遗传学技术和光热技术在生物医学研究领域中都取得了相当大的进展，为其在今后的临床应用提供了科学的理论依据。然而，光遗传学技术目前采用的病毒载体应用于临床还有一定的生物安全风险。为此，学者们将纳米材料硫化铜作为新型载体联合光遗传学技术应用于癫痫的治疗中，为其研究和探索开辟了一条崭新的道路。

研究者通过对纳米材料硫化铜进行加工修饰和改良，形成新型纳米材料，提高了其水溶性、稳定性和生物相容性，并增强了纳米材料在体内的降解速度和代谢效率。同时，将光敏蛋白基因(如ChR2、NpHR基因)与纳米材料共同组装成硫化铜纳米颗粒，并靶向地转染到癫痫病灶中特定的神经元区域，亦可利用CED技术，将纳米颗粒高效运输到靶细胞中，从而减少周围正常组织细胞的摄取，降低了对其产生的影响[33]。随着光敏蛋白基因在体内的高效表达，利用光遗传学技术可以实施对靶细胞的精准调控。另外，也可以直接将光敏蛋白装载于纳米材料中，运用相同的技术手段，可以有效地控制痫性放电的发展和传播。在纳米材料硫化铜与化疗药物疗法相结合的研究中，可以利用超小尺寸的硫化铜纳米颗粒作为载体，将抗癫痫药物共轭到载体上，形成新型纳米颗粒，通过近红外激光照射，抗癫痫药物可以从纳米颗粒中释放，实施对癫痫病灶的靶向治疗。同时，光热治疗增强了细胞代谢作用和细胞膜的通透性，进一步促进了癫痫病灶对药物的摄取，增强了抗癫痫药物的疗效。与此同时，癫痫病灶中的神经元细胞不同于肿瘤细胞，与周围正常组织细胞同样具有良好的耐热性，分解出的纳米材料硫化铜利用光热效应不会对神经元细胞产生影响。

目前，此项联合治疗仍然处于研究探索阶段，对于光遗传学技术应用于临床中癫痫的诊断和治疗还有一些问题亟待解决，例如光源的分散性、对组织的穿透能力不够、不能有效地对深层癫痫病灶实施精准调控、光敏蛋白的激活光谱存在重叠，以及在神经元细胞群中属于异源性表达，对于本身正常的功能是否存在影响等，这些问题在一定程度上限制了光遗传学的临床应用。虽然通过化学、物理等方法对纳米材料硫化铜进行了修饰，有效地降低了本身的毒性，但其在临床应用中对人体的毒性和代谢途径还需要进一步的研究与考察。

参考文献略

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