使用CRISPR-Cas9系统进行人源细胞遗传学筛选研究
背景
某个细胞过程相关基因的高效识别对于生物学研究具有十分重要的意义。在哺乳动物细胞中使用RNAi的方法是目前用来做筛选的最主要的方法。但是RNAi只能在mRNA水平抑制基因的表达并且有可能作用于其他mRNA而产生脱靶效应，因此可能产生很多假阳性和假阴性的结果。细菌来源的CRISPR-Cas9基因编辑系统由于其在基因组中作用范围广并且能够快速得到发生基因编辑的细胞系和小鼠，从而成为了哺乳动物遗传学研究十分重要的工具。
本文作者通过设计针对7,114个基因位点的sgRNA（共73,151个sgRNA），利用CRISPR-Cas9系统构建了含有7,114个基因的突变细胞库，为人类疾病研究和药物研发提供了十分宝贵的研究数据和使用资源。
方法
1.sgRNA的设计
sgRNA是针对基因所有的isoforms的外显子的公共区并且靠近起始密码子的序列而设计的。同时通过比对sgRNA序列和基因组中其他区域序列的相似性去除掉潜在脱靶率高的sgRNA（图1）。每个基因设计约10条sgRNA（表1）。
图1 sgRNA设计流程
表1 sgRNA设计数量分布
2.sgRNA文库构建和病毒包装
将设计好的sgRNA合成oligo pool，然后再将合成的pool经过富集和克隆，构建到CRISPR载体中。最后将构建好的CRISPR质粒文库包装到慢病毒中，用于下游的细胞侵染实验（图2）。
图2 sgRNA文库构建和病毒包装流程
3.侵染细胞和文库质检
为了检测构建的质粒文库的质量，作者将包装好的病毒侵染细胞24小时后对细胞中sgRNA barcodes进行深度测序（图3 ）。测序显示侵染到细胞中的sgRNA种类的覆盖率大于99%，并且90%的sgRNA reads数是10%的sgRNA的reads数的6倍（均一性），统计结果见图4 。
图3 细胞侵染实验流程
图4 sgRNA文库累积分布函数图
（红色曲线是对细胞转染24小时后进行的测序结果统计，蓝色曲线是对细胞传12代后的测序结果统计。）
4.细胞特定功能基因的筛选
为了验证构建的sgRNA文库能够筛选出特定细胞过程相关的基因，作者进行了和DNA错配修复（MMR）功能相关基因的筛选。在碱基类似物6-硫鸟嘌呤（6-TG）的作用下，MMR正常的细胞无法进行DNA错配修复从而停止在G2-M细胞周期，不能正常扩增繁殖。但是MMR缺陷型细胞仍然可以持续繁殖。
作者将构建的sgRNA文库病毒侵染MMR正常的细胞并且将侵染后的细胞在6-TG浓度可以杀死MMR正常的细胞培养基中培养。然后将存活下来的细胞进行sgRNA barcodes测序。
测序统计显示针对MMR通路中四个重要基因（MSH2，MSH6，MLH1和PMS2）的sgRNA在6-TG培养基中存活的细胞中富集程度最高，统计结果可见图5 。
图5 原始丰度图
（细胞侵染了文库病毒后在6-TG培养基中培养12天后的统计结果）
结论
本文整合了CRISPR-Cas9系统、病毒包装技术以及高通量测序技术，实现了针对人基因组特定代谢通路突变细胞库的构建，并且建立了一套详细同时可行性强的高通量细胞筛选方法，为科学家进行人基因组中特定代谢功能基因的研究奠定了强有力的基础。
金唯智拥有全球领先的基因合成技术，能够完成高质量、高难度和高效率的基因合成。同时配备完备的一代、二代和三代测序平台。结合这些产生优势，金唯智的基因编辑平台提供从sgRNA批量设计、Oligo pools合成、质粒文库构建到病毒包装的细胞高通量筛选一站式服务。
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