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文献综述 | 肠道菌群定植与B淋巴细胞免疫的研究概况

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2024-11-06 01:14

哺乳动物在出生后，其黏膜组织暴露于环境，外界的病毒、细菌、原虫、真菌定植于此，从而形成复杂的微生物群体，统称为共生菌群。哺乳动物的共生菌群由1 000多种不同的微生物构成，数量是宿主细胞的10倍以上[1]。越来越多的研究显示，肠道菌群失调可引起全身免疫性疾病[2]、肥胖[3-5]、肠癌[6-7]、哮喘、肝硬化[8]等。因此，肠道菌群与许多疾病的发生、发展密切相关，这已经成为近期的研究热点。就肠道菌群的研究方法来说，近几年研究者们摆脱传统细菌培养法的局限，运用荧光原位杂交、16SrDNA指纹图谱技术、宏基因组测序技术等多种分子生物学技术，定性和定量地研究肠道菌群的变化。随着高通量测序技术的快速发展，宏基因组测序和16S测序已经被广泛用于肠道菌群构成和特征的全面分析[9-10]。一般认为肠道菌群与脊椎动物共同进化，它们在宿主免疫系统中也起着重要的作用。越来越多的研究显示，肠道菌群定植可促进机体淋巴组织发育，参与固有免疫和适应性免疫系统的调控。在固有免疫中，肠道菌群通过机体模式识别受体，与机体相互作用，参与免疫分子的调控，如近期有研究者利用SPF级小鼠粪便来研究肠道菌群在体外对骨髓巨噬细胞的作用，发现肠道中的P.mirabilis能使CCR2+单核细胞介导的NLRP3激活，并使IL-1β分泌[11]。肠道菌群也参与了适应性免疫的调控，其可诱导IgA的产生以及参与T淋巴细胞的调控[12]。本文就肠道菌群定植与机体肠道免疫系统、免疫组织、B淋巴细胞(简称B细胞)及黏膜免疫调节之间的关系进行综述。

图片来源：scottresnickmd

1 肠道菌群定植对机体自身及后代肠道免疫系统的影响

正常婴儿出生后与外界接触，就会有大量的肠道菌群在肠道定植，大约3个月时肠道菌群逐渐形成一个稳定的群体[13]。早期肠道菌群定植具有特征性变化，在婴儿刚出生后的几小时，大量的需氧菌和兼性厌氧菌定植在肠道内，2～3 d后主要是厌氧菌定植，5～7 d后肠道中双歧杆菌定植增加并达峰值，最后渐渐趋于稳定，成为婴幼儿期肠道中的主要菌群[14]。早期肠道菌群定植对机体免疫系统有一定影响。2016年，Gensollen等[15]通过在无菌小鼠肠道中定植益生菌来研究早期肠道菌群定植对机体成年期免疫系统的影响，发现出生后2～4周是肠道菌群定植最关键的窗口期，这个时期与肠道免疫系统耐受的形成和超敏反应的产生等密切相关。肠道菌群定植不仅对机体自身免疫系统有影响，对后代子女的免疫系统也有影响。2016年，有研究者在无菌孕鼠的肠道中定植能够自动逐渐减少的大肠埃希菌，使孕鼠生产时肠道恢复无菌状态，来研究其产下的后代小鼠的免疫系统，发现后代小鼠肠道中具有较多单核细胞，且免疫功能相关基因的表达水平明显升高，为了进一步进行验证，研究者又给无菌的孕鼠肠道定植其他8种细菌，其产下的后代小鼠也出现了类似的结果[16]。综上所述，婴幼儿期肠道菌群定植在“教育和塑造”机体肠道免疫系统中起到关键的作用，也可能影响其后代机体的肠道免疫功能。

2 肠道菌群定植对肠道及相关免疫器官发育的影响

近年来，研究者通过应用无菌(germ free, GF)级动物、悉生(gnotobiotic， GN)级动物、无特定病原体(specific pathogen free, SPF)级动物等动物模式，来研究肠道微生物定植与宿主的关系。其中无菌动物的产生和研究，极大地推动了肠道菌群与宿主之间相互作用关系的研究。早期，人们就比较GF级、GN级、SPF级等动物模型免疫器官的组织结构，发现GF级动物免疫器官的组织结构存在发育不良的现象：胸腺的上皮细胞变大，胞浆泡状结构及溶酶体变小；脾脏与外周淋巴结的发育受到限制；盲肠膨大，肠道壁变薄，肠系膜淋巴结(mesenteric lymph node， MLN)和派氏淋巴结(Peyer′s patches， PP)较小，原始生发中心变小，导致B细胞、浆细胞的数量减少[17-19]。2013年有文献报道，肠道菌群定植可诱导胃肠道成熟，促进肠道形态发生巨大变化，包括绒毛结构、隐窝深度、血管密度、黏液层性质以及黏膜相关淋巴样组织[20]。还有研究显示，PP和MLN的发育早期受胚肝的淋巴组织细胞诱导[21]，而出生以后二者的发育依赖于肠道菌群定植[22-23]。综上所述，肠道菌群的定植可以促使机体肠道及相关免疫器官发育和成熟。

3 肠道菌群定植对B细胞亚群和受体库的影响

早期认为，肠道菌群可能对淋巴细胞的发育或内环境进行远程控制。大量研究显示，肠道微生物定植及CD8+T细胞的参与，可以塑造外周适应性免疫细胞群体如边缘区(marginal zone， MZ)B细胞、恒定的NKT细胞和浆细胞样树突状细胞的功能[24-26]。2011年，Hansson等[27]以GF级和普通条件下饲养(conventional， CV)级小鼠为研究对象，对不同月龄的2种小鼠骨髓中各发育阶段B细胞(早期祖B细胞、前BⅠ细胞、大前BⅡ细胞、小前BⅡ细胞、幼稚B细胞、成熟B细胞)以及脾脏中各发育阶段(过渡期B细胞、滤泡区B细胞、MZB细胞)B细胞总数进行比较研究，发现随着月龄变化，GF级与CV级小鼠骨髓和脾脏中各发育阶段的B细胞数量变化无显著差异，30～40 d时小鼠骨髓B细胞各亚群数量都达到了峰值，但是对成年GF级和CV级C3H小鼠脾脏和PP的B-2细胞，通过全基因组转录组学进行对比分析，发现2种小鼠B-2细胞免疫相关基因表达存在显著差异。因此，肠道微生物的定植，不影响骨髓和脾脏中发育的B细胞亚群数量，但是可能影响脾脏和PP中B-2细胞相关基因的表达。

2012年，有研究者以65个瑞典婴幼儿为研究对象，通过细菌培养来检测这些婴幼儿出生后1、2、4和8周肠道中所定植的菌群，通过流式细胞术检测这些婴幼儿出生后3～5 d、1个月、4个月、18个月、36个月外周血中CD20+CD27+B细胞的数量及比例，结果显示出生后4和8周肠道定植有大肠埃希菌和双歧杆菌的婴幼儿，在4和18个月时外周血中CD20+CD27+B细胞数量显著升高，其中CD27是人体记忆B细胞的表面标志，因而推测早期肠道菌群包括大肠埃希菌和双歧杆菌的定植会促进人体B细胞的成熟[28]。2016年，Beura等[29]将肠道菌群构成和多样性存在较大差异的宠物店小鼠和实验室小鼠作为研究对象，通过流式细胞术检测2种小鼠脾脏和MLN中B-1细胞、生发中心IgM+B细胞、IgM+滤泡B细胞、类别转换生发中心B细胞、类别转换滤泡B细胞、浆细胞的比例，结果显示宠物店小鼠脾脏和MLN中类别转换生发中心B细胞、类别转换滤泡B细胞、浆细胞的比例均升高，其中浆细胞比例升高得最明显。综上所述，肠道微生物定植不影响骨髓和脾脏中各发育阶段B细胞的数量，可能促使机体外周免疫组织器官中B细胞的成熟，也可能促使成熟B细胞的比例升高。

肠道菌群定植对小鼠B细胞受体(B cell receptor, BCR)库的多样性也有影响。2013年，Wesemann等[30]发现小鼠B细胞的发育也发生在肠道固有层，从而进一步研究肠道菌群对肠道固有层BCR库重排编辑的影响，研究者给断奶期的GF级小鼠定植肠道菌群后，与同月龄的GF级小鼠比较，发现其肠道固有层B细胞中RAG2+B细胞比例显著升高，RAG1和RAG2基因上调，肠道固有层B细胞Igλ/Igκ(BCR编辑标志)的比例显著升高，B细胞BCR重链和轻链CDR3组库对V基因的取用均存在差异，此研究推测早期肠道的微生物定植，可能会影响BCR库V、D、J基因的重排编辑，从而可能影响肠道固有层B细胞BCR重链和轻链CDR3组库的多样性，但其机制尚不清楚。2015年，Lindner等[31]以GN级小鼠和GF级小鼠为研究模型，提取小鼠小肠组织的RNA，反转为cDNA，构建BCR H-CDR3组库并进行高通量测序，解析小鼠小肠IgA抗体库的构成。通过大量数据分析发现，与GF级小鼠相比，GN级小鼠小肠IgA抗体库的VH、JH、DH基因取用均无明显差异，但是小肠IgA抗体库多样性存在显著差异，其中定植肠道的微生物种类越多，小肠IgA抗体库多样性越丰富。进一步探索IgA抗体库多样性的机制，该研究者发现记忆B细胞可以在不同PP中循环、变化和更替，对多元化IgA抗体库的产生具有重要的作用，但其机制尚不清楚。

4 肠道菌群定植对B细胞免疫的调节

近年来发现肠道菌群定植在免疫球蛋白的产生过程中也起着重要的调节作用。早期研究显示，GF级幼猪的肠道PP发育不成熟，并且分泌IgA的水平降低，在其肠道植入菌群后，其血清中IgA和IgM水平升高[32]。还有研究通过对幼年和成年的GF级和CV级小鼠外周血中IgA、IgG、IgM的分泌水平以及肠道中IgA的分泌水平进行对比研究，发现与成年GF级小鼠相比，成年CV级小鼠外周血和肠腔中分泌的IgA水平均显著升高，对成年GF级和CV级小鼠脾脏和肠道PP的B细胞进行体外实验验证，发现在外界抗原刺激下，2种小鼠B细胞克隆增殖的数量相同，但CV级小鼠肠道的PP中B细胞分泌的IgA、IgG和IgM水平均显著升高，并且脾脏中B细胞分泌的IgA水平也显著升高，说明肠道菌群定植不影响B细胞的克隆增殖，但可提高其分泌抗体的能力，特别是分泌IgA的能力[27]。2013年，Cahenzli等[33]发现，GF级小鼠IgA和IgG的分泌减少，但是出生后约1个月的GF级小鼠血清中IgE的水平升高，推测这可能与PP和MLN的B细胞分泌的IgE转换率升高有关，IgE的分泌水平升高会导致哮喘等超敏反应性疾病的易感性增加，机体可能需要多样性的肠道菌群来建立适当的免疫调节网络，以抑制IgE的产生。因此，肠道菌群定植可诱导肠道固有层和PP的B细胞分泌IgA、IgM、IgG增加，其中IgA升高最明显，而分泌IgE减少。

现阶段，肠道菌群定植对IgA的诱导可分为T淋巴细胞依赖型和T淋巴细胞非依赖型，前者多发生在肠道PP部位，后者主要发生在肠道的固有层和孤立淋巴滤泡部位。T淋巴细胞依赖型诱导IgA过程即PP中的DC通过M细胞捕获并提呈肠道微生物抗原，诱导初始CD4+T淋巴细胞分化为滤泡辅助性T细胞亚群，通过CD40L和IL-21诱导B细胞表达活化诱导胞嘧啶脱氨酶(activation-induced cytidine deaminase, AID)，从而促使B细胞进行IgA的类别转换，并发生体细胞高频突变，产生高亲和力IgA。T淋巴细胞非依赖型诱导IgA过程即肠道DC捕获抗原后，通过B细胞激活因子诱导B细胞AID的表达，发生IgA类别转换，不发生体细胞高频突变，产生低亲和力IgA[34]。据报道，共生菌诱导机体产生的IgA与病原菌不同，共生菌可刺激机体通过T淋巴细胞非依赖途径产生“原始”IgA即低亲和力IgA，病原菌可刺激机体通过T淋巴细胞依赖途径产生“经典”IgA即高亲和力IgA[35]。早期还有研究显示，在GF级小鼠肠道中发现少量分泌型IgA，称“天然”IgA，其抗原亲和力较低，通过对“天然”IgA抗体库进行测序显示，这种“天然”的IgA抗体库与SPF级小鼠多克隆和寡克隆的浆细胞受体库很相似[36]，“天然”IgA是自发产生的还是自身抗原刺激产生的，目前还不清楚。因此，受外界微生物刺激后，机体怎样区分“坏菌”、“好菌”和自身抗原，以及协调不同途径产生不同亲和力的IgA，来保留“好菌”，杀死“坏菌”，有待进一步探讨。

5 结语

近期，肠道微生物与免疫的研究已成为热点，随着不断深入的研究，肠道菌群定植对B细胞免疫的影响机制终将被揭晓，这对肠道菌群与肠道相关疾病的发生、发展及治疗的研究也有帮助。2016年，Dubin等[41]报道提示在肠道中增加某些菌群的数量，对预防结肠癌的发生可能有重要作用。因此，随着人们对肠道菌群与免疫系统相互关系的认识越来越全面，也许不久的将来，可以通过调节机体的肠道菌群来治疗肠道相关疾病，为治疗相关疾病提供新的方法。

参考文献

潘雨蓉, 姚新生. 肠道菌群定植与B淋巴细胞免疫的研究概况[J]. 现代免疫学, 2018, 038(006):519-522.

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