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脊髓损伤动物模型的运动功能评价方法

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2024-11-07 19:30

摘要：不同的脊髓损伤动物模型呈现出不同类型的解剖结构损伤，同时伴随着相应的行为学变化。评估损伤后的运动功能不仅能直接测量脊髓再生、修复和神经功能重建情况，也是神经保护药物药效学试验不可或缺的部分。本文综述了国内外已建立的评价方法，探讨了其在实验治疗学中的应用，旨在为研究者选择适宜的评价方法提供指导。

脊髓损伤（SCI）源于椎体移位或碎骨片侵入椎管，导致脊髓或马尾神经不同程度的受损。这种损伤引发了损伤部位运动、感觉和括约肌功能障碍、肌张力异常以及病理反射等改变。国内外已建立了多种SCI动物模型，如脊髓挫伤、压迫损伤、横断损伤、缺血损伤、牵张损伤和化学损伤，并在部分研究中进行了神经保护药物的药效学筛选。然而，动物模型与临床SCI仍存在差异，因此需要建立完整、客观的运动功能评价系统，以深入探讨SCI发生机制和损伤后修复治疗方法。

现有SCI动物模型的运动功能评价方法可大致分为开放场地试验、非开放场地试验和联合行为学评分法三类。本文对这些方法及其优缺点进行了系统综述，方便研究者根据实验治疗学的需求选择适宜的模型和评价方法。

Tarlov法（Tarlov test）是1953年首次描述的一种开放场地试验，最初应用于动物脊髓压迫损伤后的运动功能评价。该方法关注关节活动度、是否能够行走和跑步等方面。Tarlov法在灵长类动物中表现较为可靠，与脊髓损伤程度、神经功能恢复以及轴突残存数量等有较好的相关性。然而，在啮齿类动物中的一致性较差，可能受观察者主观随意性和实验环境的影响，导致重复性不高。

随后，许多学者对Tarlov法进行了改良，并将其应用于大鼠后肢功能评价。例如，Kazanci等使用Tarlov法评估家兔脊髓缺血损伤后的运动功能，发现美西律对神经功能的改善和组织病理损伤的缓解具有显著作用。另一方面，Liang等研究了川芎嗪和去铁胺联合治疗大鼠脊髓缺血损伤的效果，发现治疗组的Tarlov评分明显高于对照组，且与形态学改变存在相关性。

尽管Tarlov法相对简单，但其评分跨度大，容易呈现跳跃性分布，难以准确判别啮齿类动物SCI程度上的差异，也难以全面展示神经功能恢复的整个过程。因此，Tarlov法主要适用于啮齿类动物SCI程度的初步筛选，它可以与其他行为学方法结合使用。例如，Akdemir等使用改良后的Tarlov法和斜板试验评价了SJA6017（一种钙蛋白酶抑制剂）治疗后SCI大鼠后肢功能的改善状况，提示抑制钙蛋白酶诱导的细胞凋亡可能是一种可行的SCI治疗策略。

2. BBB 法(Basso-Beattie-Bresnahan test)

1995 年，Basso 等基于 Tarlov 法的开放场地试验提出了一种新的神经运动功能评价方法，即 BBB 法。该方法分级较细致，几乎包括了 SCI 后大鼠后肢恢复过程中的所有行为学变化，并与脊髓损伤的程度高度相符。许多研究者较为推崇这种方法，认为它是评价大鼠 SCI 后后肢运动功能恢复情况的一种有效工具，尤其对于低位胸段脊髓挫伤后的运动功能评价。

BBB 法的操作过程包括将动物置于环形封闭金属壳内，由两名观察者对侧站立，观察后肢运动功能变化的过程。观察期为 5 分钟，在此期间，观察者按照评分标准进行评分。评分结果可将 SCI 分为瘫痪、早期恢复、中期恢复和最终恢复四个阶段。

Basso 等强调，BBB 法不仅适用于评价运动功能恢复情况，而且评分结果具有灵活性，可用于研究运动功能恢复机制。由于评分呈渐进性排列，能够反映早期、中期和晚期的行为变化，揭示了 SCI 恢复的全过程。此外，一些研究者如 Lankhorst 进一步增加了数据的输入、储存和分析，以便更方便地进行数据比较。

BBB 法在评价前后肢运动功能时需要双盲、双人独立观察记录，以确保评分结果更具客观性。然而，由于评分细节较多，初学者可能难以掌握。另外，需要注意的是，BBB 法主要适用于轻、中度损伤，对于重型损伤的评判敏感性较低。

3 . 步态分析法 (Footprint Analysis)

de Medinaceli等人于1982年首次引入足迹分析法，并在大鼠神经运动功能评估中应用。Metz等后续进行了多项改良。该方法涉及将试验动物的爪子涂上不同颜色的墨汁，然后让其在木杆上行走，通过分析跨步距离、爪子负重以及爪子活动角度等指标来评估。然而，由于测量动物跨步距离和爪子活动角度的精度较低，可靠性较差。

Jia等研究报道传统中药疏血通能显著促进脊髓血液循环，减少继发性损伤，保护缺血区神经元。通过采用Tarlov评分法和足迹分析法，证实疏血通能促进损伤脊髓的运动功能恢复。

VisuGait分析系统是在BBB法之后学术界广泛推崇的一种研究动物步态的自动评价系统。建议对于重要的实验治疗学结果，使用VisuGait分析系统进行验证。该系统能够提供大量不同运动功能的分析数据，包括着地时间、悬空时间、步长、左右脚间距、步序等。

相较于BBB法，VisuGait分析系统克服了动物快速运动难以准确评估的缺陷，尤其适用于前后肢协调性的评估。此外，该方法显著减少了人为因素的影响，提高了评价结果的可靠性。Salazar等使用VisuGait分析系统和BBB法观察小鼠脊髓挫伤后30天，评估了移植人类神经干细胞的治疗效果。结果显示，小鼠运动功能在移植后的第二天就明显改善。

跑台试验是在VisuGait分析系统的基础上进行的一项改进，通过将透明跑道转换为可运转的跑步带，更有利于步态分析。该试验可用于研究动物肢体协调性以及水平或倾斜步态力学分析，特别适用于小型啮齿类动物。与步态分析相关的参数与跑步带的速率呈相关性，使得对不同阶段神经运动功能的评估更为便利。跑台试验不再需要在试验动物的前后肢涂墨汁，从而弥补了脚印分析的缺陷。

由于跑台试验广泛应用于大脑感觉运动皮质损伤和脊髓损伤后的神经再生研究，然而其不足之处在于需要购置昂贵的带有高速摄像机的跑步机以及配套的数据采集分析软件。Li等的研究表明，激活Nogo-66受体可以促进成年中枢神经系统损伤后的轴突生长，跑台试验、改良的BBB法、斜板试验和倾斜网格爬行评分在这方面均取得了显著的提高。

网格爬行是一种评估动物脑或脊髓损伤后是否精确控制后爪放置能力的方法，主要适用于小型动物如猫、鼠。

该评价方法根据网格放置角度的不同可分为水平网格试验和倾斜网格试验。在这一方法中，试验动物被置于水平或倾斜的网格上（两杆之间距离为2.5cm），通过训练动物在网格上方寻找食物与水，记录大鼠后爪失足、发出脚步声以及通过这段距离的时间等行为学数据。然而，该方法的缺点在于网格线太细，对后肢失足不易评价，并且要求训练者对每个细节有准确判断，人为因素影响大，耗时费力且费用高。同时，动物行走速度过快时不易观察。

Prakriya等后来建立了一套自动分析系统用于网格爬行试验，首次应用于评价T12-T13脊髓背侧横断损伤后的行为学改变。这一系统具有操作简便、耗时短、可比性高等优点，尤其在行为学判断上更为精确，特别是对脚步声的持续性判别。然而，仍然存在难以检测轻微失足等细小行为变化的难题。此外，由于一维感觉模式的局限，难以区分左右后肢的脚步声。

Xu等的研究采用神经干细胞移植和NgR免疫接种联合治疗成年大鼠SCI后的运动功能，发现网格爬行试验的指标和BBB评分较单个药物治疗效果更为显著。

平衡木行走涉及两种试验：阶梯平衡木（ladder beam test）和狭窄平衡木（narrow beam test）。前者旨在评估动物控制前后爪的放置能力，方法是将动物放置在阶梯平衡木上，记录前后肢在杠杆上滑落的次数，采用DV视频收集数据。Cummings等人制作了改良的阶梯平衡木装置及其评分系统，成功用于评估T9脊髓挫伤小鼠的后肢功能。该方法的关键之处在于水平阶梯平衡木行走试验能够区分在开放场地试验中脚步频率相等的小鼠。该方法的特点包括受试对象训练时间短、参数评估准确，试验过程容易进行重复观察。其次，该方法有助于辨别小鼠BBB评分中第5～7点和大鼠BBB评分中第9～13点的行为变化。然而，与BBB法不同的是，该方法主要用于评价感觉运动皮质损伤或脊髓损伤，特别是高位颈部脊髓损伤引起的前后肢功能障碍。此外，该方法还能评估特定区域的功能恢复能力，如负重行走。Fiore等人将阶梯装置倾斜至40°，建立了倾斜阶梯平衡木试验以分析小鼠失足指标。他们发现，对中等程度脊髓挫伤的小鼠采用神经甾体脱氢表雄酮治疗后，运动行为障碍减轻，而且行为学结果与神经病理学改变呈一定相关性。1975年，Hicks等人建立了狭长平衡木装置，用于评估大鼠脊髓损伤后的身体平衡能力、失足次数等指标，适用于脊髓损伤模型及颅脑感觉运动皮质损伤的行为学评估。根据试验要求，通常将平衡木分为三种规格：1.2厘米、2.3厘米的矩形平衡木和2.5厘米直径的圆柱形平衡木。Kunkel-Bagden等人认为狭窄平衡木试验可用于定量评估脊髓损伤大鼠的运动功能。郭丽萍等人采用改良的狭窄平衡木试验评估大鼠颅脑损伤后的协调肌肉运动和平衡能力，并对损伤程度进行了量化测试。该方法的缺点在于平衡木越狭窄，试验动物的失足次数越多，导致评估结果的可靠性降低。Merkler等人报道，在采用Nogo-A（一种髓鞘相关轴突生长抑制剂）抗体中和抑制性抗原的抑制作用研究中，狭窄平衡木试验、BBB评分以及爬网格试验评分结果都有显著提高。

7. 胸腰高度试验 (Thoracolumbar Height Test)

胸腰高度试验通过监控设备观察大鼠在透明跑道走廊上的胸腰椎高度，以此分析大鼠后肢是部分负重还是全部负重。van de Meent等人将脊髓损伤后的大鼠置于三种不同类型的环境中，分别采用胸腰高度试验、BBB评分、VisuGait步态分析以及网格试验评估其行为学改变。研究结果显示，脊髓损伤大鼠在富裕环境中进行训练达到一定阈值后，运动功能会明显改善，但运动功能的恢复不会再随着训练强度的增加而增加。然而，该方法不适用于轻度或极重度的脊髓损伤模型的行为学评估，仅可作为行为学评价的辅助手段。

8. 斜板试验 (Inclined Plane Test)

斜板试验装置由两个直角夹板构成，通过铰链连接。夹板的一侧设有可调节角度的板，以方便调整试验的角度。该方法将实验动物放置在斜板上，通过调整斜板的角度来获取动物在SCI后能够在斜板上保持5秒的最大角度值。斜板试验设备简单制作，方法简便，具有良好的重复性，无创伤性，并且与SCI程度高度相关，适用于轻度至中度SCI模型。1998年，Yonemori等人对斜板试验进行了技术改进。具体方法是将大鼠放置在水平斜板上（0°），然后逐渐升至30°作为起始角度，以2度/秒的速度增加，直到动物从斜板上滑落，记录最大角度值。Han等研究表明，在实验性SCI大鼠中给予降血脂药物辛伐他丁后，斜板试验角度和BBB评分均显著提高，这种神经保护作用可能与BDNF和GDNF的上调有关。国内学者通过将斜板试验与Tarlov法结合的方法，观察中药龟板对大鼠SCI后后肢功能的恢复情况。为了使该方法更加可靠，通常将整个实验过程分为预实验和正式实验两个阶段。预实验的目的是使试验动物适应环境，避免在正式实验中出现恐惧神态而影响评估结果。然而，斜板试验的缺点在于难以揭示大鼠神经功能的微小改变，例如爪的位置、尾巴的下垂或上翘，从而影响对运动功能整体评价。Song Huanjin等通过对银杏叶提取物治疗大鼠SCI后下肢运动功能恢复程度的观察，结果显示斜板试验和BBB法的检测值与脊髓损伤程度存在明显相关性。研究认为，多种行为学评价方法的结合可以弥补单一评估方法的不足，有效提高评分的准确性和敏感性。

9.肢体肌力试验 (Limb Muscle Strength Test)

肢体肌力试验可根据实验装置的不同分为肢体悬挂试验（Limb Hanging Test）和肢体握力试验（Limb Grip Strength Test）。前者主要用于前后肢功能的评估，尤其是在颈段脊髓损伤后评估前肢肌肉功能。Diener等人建立的肢体悬挂试验装置由15cm长、2mm直径的木棒构成。在试验中，将动物的前爪轻放在一根悬挂木棒上，通过检测动物握紧木棒的能力和时间来评估肢体肌力。与Tarlov法相比，对于中度至轻重度损伤的动物模型，其评估结果更为准确。然而，该方法对于轻度或极重度损伤的敏感性较低，因此需要与其他行为学方法结合使用。肢体握力试验的方法是通过让实验动物握紧装有握力表的套圈，通过握力表的读数来衡量动物运动肌力的恢复情况。Anderson等人指出，肢体握力试验具有便捷、可定量分析的特点，适用于颈段脊髓损伤模型的前肢运动功能评估，但不适用于重度损伤模型。Aguilar等人采用改良的肢体握力试验评估小鼠C5双侧脊髓损伤后前肢的运动功能。

10.联合评分法(combined behavioral score)

Gale等在Tarlov法与斜板法相结合的基础上增加感觉、反射等一些指标建立了联合评分法(CBS)，内容包括后肢运动、斜板试验、伸趾、回缩反应、热板试验和游泳等7项。各项数值代表SCI后神经功能丧失的百分比。CBS法能较为准确地综合评定SCI大鼠运动、感觉等多方面神经功能。缺点是所需设备较复杂、人为因素较多而不利于推广。

此后Kerasidis等对CBS评分标准进行修正，删减了其中的“正常行走: 0分”选项，将“后肢能负重，会步行1次或2次”改为“后肢能负重，会步行数次”，从而减少人为因素，提高了评分的可靠性。von Euler等在不同程度的脊髓压迫损伤模型上证实，采用CBS法和BBB法评价的运动功能结果与组织形态学改变有很好的相关性。

Hara等报道盐酸法舒地尔(异喹啉磺胺衍生物)治疗大鼠T3脊髓压迫损伤的疗效。研究中采用改良的CBS评价SCI动物的运动功能，结果药物组的行为学指标明显好于甲强龙对照组。国内学者研究了手术减压对大鼠慢性SCI的作用及相关机制，CBS结果表明手术减压治疗可促进脊髓运动神经元合成乙酰胆碱转移酶，改善动物运动功能。

临床SCI往往是多种类型的损伤相互并存，单纯某一类型的损伤并不多见。不同的脊髓损伤动物模型复制出不同类型的解剖结构损伤以及相应的行为学改变，以至于任何一种动物模型都不可能完全模拟临床SCI的特征。

目前临床SCI神经运动功能的评价仍然沿用美国脊髓损伤学会/国际脊髓学会分级标准。内容包括神经系统检查的评价、辅助检查的评价(指影像学和电生理学检查)和日常生活能力的评价3个部分。神经系统检查的必检部分有神经损伤水平、感觉平面、运动平面、损伤程度评分、骶部残存、部分保留区、完全或不完全损伤和四肢瘫或截瘫。

然而，这套分级标准仍存在局限性，如功能独立性评定不能完全反映损伤患者的恢复情况等。Chafetz等报道如何提高运动感觉评分的精确性，指出不论医生在SCI领域的经验如何，接受正式的标准化培训是至关重要的。因此，理想的动物模型运动功能评价方法必须紧密结合临床实际SCI评价标准，首先受试对象个体影响小，能较好地对不同阶段的神经行为学改变作出准确判断;其次要求评价装置成本低廉，使用简便，实验耗时短。