动物行为实验指南：解析慢性社交挫败应激模型测试流程及注意事项
摘要
神经精神病学研究中的重大挑战之一便是开发能准确反映与情感障碍相关的症状的动物模型。慢性社交挫败应激模型已被证明是研究抑郁症的有效模型。在该模型中，C57BL/6J小鼠连续10天遭受CD-1小鼠攻击，诱导其产生慢性社交挫败应激。本文描述了CD-1攻击小鼠的筛选过程，C57BL/6J和CD-1攻击小鼠之间的社交互动，以及作为抑郁样行为指标的社会回避评分的分析。
关键词：社交挫败，抑郁，慢性应激，社会互动，小鼠模型
研究背景
抑郁症是一种反复发作且危及生命的疾病，影响着全球约1.2亿人。在神经精神病学研究领域中，开发有效的抑郁症动物模型至关重要，有效的动物模型可帮助人类理解抑郁症背后的神经和分子机制。目前，用于诱发小鼠的抑郁症的各种慢性应激包括：慢性不可预测应激，足部电刺激应激，束缚应激等，随后可测量其快感缺失或绝望行为（如蔗糖偏爱测试，强迫游泳测试和悬尾测试），但这些慢性应激诱发的抑郁效果都不够理想。与此同时，慢性社交挫败应激由于其可靠性和可重复性，已被广泛接受为抑郁症的有效模型。社交挫败范式已被证实为一种很好的抑郁模型，原因如下： 1)易感小鼠的抑郁表型（社交回避、快感缺失、代谢变化等）可通过慢性抗抑郁药物的治疗而逆转，但急性给药对其没有效果。2)社交挫败应激产生易感表型和抗性表型可以用来解释抑郁症病理生理学中人类应激易感性的个体差异。3)由社交挫败应激引起的易感表型是长期存在的，并伴随着大脑奖赏回路的遗传和表观遗传变化。
材料和试剂
1. C57BL/6J小鼠（购自Jeckson实验室）：使用7-8周龄小鼠进行社交挫败造模（6-7周龄小鼠需要进行一周的环境适应期）
注：小鼠置于标准笼里，每个笼子限4-5只小鼠。
2. CD-1小鼠（(Charles River实验室）：将4-6个月大的雄性非繁殖鼠单独饲养于标准鼠笼内。
注：社交挫败范式使用受试小鼠的统一从属关系作为社交应激源，在本方案中采用了最常见的C57BL/6J：CD-1从属关系。
3. 清洁试剂（用于清洁场地和作为社交互动场地/分隔器的树脂玻璃）：0.5%过氧化氢。
设备
1. 透明鼠笼（带垫料的一次性鼠笼）（Innovive，目录编号：RS1-H-C8)
2. 标准水瓶（小鼠水瓶）（Innovive，目录编号：M-WB-300)
3. 带吸管的水瓶塞（氯丁橡胶塞）（Ancare，目录编号：OT-199-3”）
4. 圆筒支架（定制的塑料支架，可作为额外的水口；图2B)
5. 分隔器（定制的透明穿孔树脂玻璃板；图2B)
6. 可拆卸外壳（定制的透明有机玻璃，顶部和底部均打开；图3B)
7. 秒表
8. 露天试验室（定制，44（宽）x 44（长） x 30（高）；厘米）
9. 社交互动测试视频跟踪系统（如上海欣软VisuTrack动物行为分析软件，CCD摄像机及计算机）
推荐软件
1. 动作跟踪软件： VisuTrack（上海欣软）
测试流程
注：慢性社交挫败应激实验必须符合政府和机构关于实验动物护理和使用的标准。
1. CD-1攻击性小鼠的筛选
a. 订购4-6个月大的雄性CD-1小鼠（至少多订购2-3倍，因为只有不到一半的CD-1小鼠具有足够的攻击性）。CD-1小鼠单独安置在标准鼠笼里，给予足够的食物和水。并使CD-1小鼠在开始筛选过程前适应它们的新环境一周。
b. 仅用于筛选CD-1小鼠的C57BL/6J雄性“筛选鼠”。 “筛选鼠”的年龄范围在8-20周，并可用于后续的筛选过程。在此过程中需要排除具有攻击性的“筛选鼠”。
c. CD-1小鼠的筛选是在CD-1小鼠的笼子中进行的。C57BL/6J“筛选鼠”直接放入CD-1小鼠笼中5 min。记录每只CD-1小鼠的攻击潜伏期，连续3天，每天一次，进行三次筛选。
d. CD-1攻击小鼠的筛选标准：在三次筛选过程中，CD-1攻击小鼠连续两个阶段初始攻击潜伏期必须小于60秒，且必须连续攻击C57BL/6J “筛选鼠”至少10秒。
e. CD-1攻击小鼠在初始筛选后可使用3个月（CD-1攻击性小鼠可能习惯社交挫败过程，因此需要在下一次社交挫败实验之前重新筛选）。
2. 慢性社交挫败应激（图1）
图1|社交挫败应激造模和社交互动测试的示意图（慢性社交挫败造模方案使用CD-1攻击性小鼠执行了连续10天的社交挫败，然后进行社交互动测试和后续分析）
a. 组装社交挫败笼（图2A)，取标准鼠笼，笼底部填充木片垫料。将穿孔的有机玻璃分隔板放置在笼子的中心。社交挫败鼠被隔离出来，并允许其在非社交挫败区域内进行感官互动。放置圆柱体（附加的水瓶架）在标准水瓶的对面。用圆筒支架插入组装好的水瓶。确保鼠能饮用到水。将食物放在两侧的底部（水和食物应随意供应）。将标准鼠笼盖牢固地放在鼠笼上。为期10天的社交挫败方案至少需要10个带有CD-1攻击鼠的社交挫败笼。
注意：分隔器应装配牢固，防止小鼠逃逸。
图2|慢性社交挫败应激的标准笼（A.用于慢性社交挫败应激造模的标准鼠笼：CD-1攻击小鼠被永久安置在穿孔分隔器的一侧，而C57BL/6J小鼠每天在两侧交换位置，以防止对攻击的习惯化。B. 标准鼠笼的附加部件尺寸（定制）：在标准水瓶侧的对面的圆筒支架装有一个额外的水瓶。在非社交挫败环节期间，穿孔的有机玻璃分隔器隔离两种老鼠（允许感官互动））。
b. 在社交挫败环节开始前一晚，将CD-1攻击鼠放置在已被分隔的鼠笼的一侧，使其适应新环境。
注：首选圆筒支架侧。
c. 在社交挫败环节的第一天，将C57BL/6J小鼠直接放入CD-1攻击小鼠同一侧。在5-10 min的社交挫败后，将C57BL/6J鼠转移到穿孔隔板的对侧，持续24小时。
注意：在社交挫败环节开始时，将C57BL/6J鼠放在靠近CD-1攻击鼠附近有助于启动其攻击性行为。可同时对10只受试小鼠进行社交挫败应激。
d. 对照组应将C57BL/6J小鼠放置在一个相同的社交挫败笼中，在穿孔有机玻璃分隔器的两侧各设置一只小鼠（将CD-1小鼠替换为C57BL/6J小鼠），持续10天，禁止任何身体接触。这些小鼠同样在隔板两侧转换。
e. 每只受试的C57BL/6J小鼠将每天面临1只不同的CD-1小鼠，连续重复上述社交挫败操作10天。
f. 在最后一次社交挫败之后，单独饲养所有C57BL/6J小鼠。所有的CD-1攻击性小鼠也都送回它们单独饲养的笼子里，用于未来的社交挫败实验（未来需要根据其攻击性重新筛选）。
3. 社交互动测试
a. 社交互动测试在最后一次社交挫败后24小时进行。在社交互动测试中，CD-1攻击小鼠对于被测试的C57BL/6J小鼠应该是完全陌生的。在进行社交互动测试前，筛选CD-1攻击性小鼠，以确保小鼠符合攻击性标准。
b. 社交互动场地如图3所示。配置视频跟踪系统（如EthoVision XT），通过跟踪软件自动收集所有数据。
图3|社交互动测试场地的示意图（A.社会互动分析的区域划分。B. 可拆卸的穿孔有机玻璃外壳，外壳内部放入CD-1小鼠）
c. 在与外部噪声源和动物隔离及红光条件下，于社交互动测试前先让受试鼠适应环境1小时。
d. 在红光条件下，每个社交互动测试都由两个2.5 min的阶段组成。在第一阶段，将社交挫败模型小鼠放入社交互动区域（在有机玻璃外壳对面的中心），并允许其在没有CD-1小鼠的情况下自由探索。
注意：在第一阶段比赛结束后，不要清理实验场地。
e. 在第一阶段结束后，将模型鼠取回，直到第二阶段。然后，将CD-1鼠标直接放入有机玻璃外壳内。
注意：将CD-1鼠从外壳顶部轻轻放下。
f. 在第二阶段，重新放入模型鼠，并让它在CD-1小鼠存在的情况下自由移动。
注意：在两个阶段之间以相同的方式放置模型鼠。
g. 在每次测试结束时。使用清洁液清洗所有设备。
h. 数据可以按照数据分析部分中的描述进行分析。
数据分析
使用自动视频跟踪系统，可以从每个试验的视频数据中计算出交互区和角落区的停留时间。在本研究中，对照组小鼠通常在互动区花费的时间更多，而模型鼠的社交互动时间显著减少（图4）。因此，小鼠的社交能力可以通过比较在CD-1鼠的互动区域内的停留时间来量化。社交互动比（SI ratio）计算方法如下：
Interaction zone time of "no target" trial——CD-1攻击鼠不存在的情况下，受试鼠在互动区域内停留时间。
SI比值低于100%的小鼠被归为抑郁易感小鼠，另一方面，SI比值超过100%的小鼠属于抑郁抗性组。在大多数情况下，超过一半的C57BL/6J小鼠在受到慢性社交挫败应激时表现出易感表型。角落区停留时间是社交回避的另一个有用指标，它往往与互动区停留时间呈负相关（图4B）。
图4|社交互动测试的统计分析
注意事项
1. 针对社交挫败应激笼的设置可以有所不同，还可以根据笼的形状和尺寸对分隔器、圆筒等附加设备进行修改或替换。
2. 社会挫败持续时间（5-10 min）可以根据CD-1攻击性小鼠的攻击性来调整，以应对适当的身体压力，避免造成严重伤害。仔细观察每一个过程，替换那些攻击性太强（持续留下开放性伤口）或在社交挫败过程中攻击性不够的CD-1小鼠。对严重受伤的社交挫败鼠实施安乐死。
3. 社会挫败方案的变化：为了缩短应激周期（例如与病毒表达周期相一致，如HSV）或减少对植入套管的损伤（例如光遗传学），可以适当缩短社会挫败应激范式的造模时间。
a. 单次最大社交挫败应激方案（1天）：将小鼠放入CD-1鼠的笼子中5分钟，然后休息15分钟；用新的CD-1鼠重复上述步骤至少两次。
b. 短期社交挫败应激方案（4~5天）：造模小鼠每天经历两次社交挫败，持续4~5天。
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