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动物行为实验指南丨大小鼠主动回避与被动回避实验方法白皮书（文章很长，值得收藏）

萌宠菠菠乐园
2024-08-18 08:02

方法检索教程

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模型概述

回避条件反射发生在生物体学习导致回避厌恶刺激的行为反应时。回避任务是基于啮齿类动物的趋暗避光特性以及对厌恶刺激的恐惧动机而建立的模型。传统上被细分为主动回避任务和被动回避任务。基本上，在主动回避中，动物学会执行某种反应，以避免惩罚。在被动回避中，动物学会不执行/克制某种反应来避免惩罚。

仪器介绍

这里主要介绍穿梭回避实验设备（图1）。硬件主要是穿梭箱，计算机和电击控制器。穿梭箱由两个相邻的隔室组成，尺寸相同（长24cm x 宽20.3cm x 高20.3cm）。两隔室之间由一个小门连接，可根据实验需要关上或打开。隔室地板由不锈钢条制成，间隔1厘米，金属格栅地板下方有一个可拆卸托盘，动物垫料放在托盘中。使用红外光束来确定动物的位置，非加热LED灯位于每个房间中。带扰频器的集成电击发生器，可输出0 – 2 mA的电击强度。

图1：穿梭箱示意图

实验方法

1实验设计和建议

1)饲养条件：行为受饲养模式的影响。单独饲养的小鼠可能与群体饲养的小鼠表现不同。

2)盲法：在操作员测试小鼠时，应编码实验组的小鼠，使其不清楚处理因素的分组，避免实验者偏倚。

3)测试顺序：小鼠应按测试顺序随机化，如果来自同一实验组的所有小鼠在来自不同组的所有小鼠之前进行测试，因为测试时间的差异可能会混淆实验结果。

4)测试时间：一天中的测试时间会严重影响任务表现。若测试持续几天，应在每天中的同一时间内进行。建议每组小鼠在一周的同一天开始由相同的人员进行测试，以减少任务中引入新的变异性。

5)性别：雄性和雌性应分组进行测试。如果做不到，但有多个穿梭箱可用时，请确保为每个性别专用一个测试设备。

6)动物数量：为了保证统计的检验效能，每组至少10 - 12只小鼠。

2饲养

1)如果动物是从商业来源、另一个研究机构或与动物行为测试结构分开的内部育种设施获得的，那么请确保至少有1周的时间来适应并从运输和运输压力中恢复过来。这种压力会对动物生理（包括心血管、免疫、内分泌、中枢神经和生殖系统的变化）和行为产生多种影响。对于某些遗传品系，可能需要更长的时间。例如，BALB/c小鼠已被证明具有高糖皮质激素水平，这是下丘脑-垂体-肾上腺轴（HPA）激活的常见指标，即使在装运后15日也是如此。适应时间不足不仅会危及动物福利，而且还会成为改变实验结果的混杂因素，威胁结果的可靠性。

2)将动物分组饲养以避免社会孤立压力，这可能导致焦虑和新恐惧症增强、运动多动、过度攻击、感觉运动门控受损、缺乏认知灵活性以及短期和长期记忆减少。在任何情况下，每个笼子应不超过4 -5只小鼠，以避免过度拥挤的压力，尽管这经常被低估，但也可能导致皮质类固醇水平和焦虑的增强。

3)标记每个小鼠，以便可以单独识别它。有许多不同的方法可以标记啮齿动物，包括作用于耳朵、被毛、尾巴或爪子。最常见的方法是耳切口、耳标、被毛上的染色斑点、尾部标记、剪脚趾等。

4)动物可以自由进食和饮水（除非动物由于特定的实验操作而需要执行食物限制和/或水限制方案）。

5)将小鼠放在至少33厘米长，15厘米宽的透明塑料笼中，以便允许自由水平移动。高度应至少13厘米，以允许完全后腿直立。作为顶盖的金属丝网格允许攀爬和啃咬行为。为笼子提供无毒的锯末垫料，建议使用白杨木。

6)饲养动物的环境应保持温度控制（21.5 ± 1°C）和湿度控制（40 ± 10%）。设置一个12h：12h固定的光/暗循环（上午8：00 开灯）。，以确保恒定的昼夜节律。小鼠是一种夜行物种（即它们主要在晚上行为更活跃）。由于它们的昼夜节律与人类不同，因此在某些情况下，可以考虑反转 12h：12h 光/暗周期（上午8：00 关灯）。但在这种情况下，动物应该也在倒置光暗循环中出生。如果小鼠来自保持规律周期的结构，不要改变它们从出生起就生活的节奏，因为这种转变会在动物中产生极大的痛苦。

7)每周更换垫料，以保持生活环境的清洁，但不要固定更高的频率，因为更换垫料对动物来说是一种压力，它们每次都会破坏所有的气味线索/痕迹和筑巢安排。切勿在行为训练或测试日之前更换，小鼠至少需要48 小时的时间适应。

3视力测试

明暗穿梭箱依赖于动物具有完好的视觉能力。视觉反射测试用于评估小鼠对视觉线索的反应能力（如图2）。试验开始时，捏住小鼠尾巴根部将其悬在桌子表面边缘上方25厘米处，然后慢慢地将小鼠向下移动，避免胡须碰到桌面。小鼠有三秒钟的时间伸展前肢并将攀在桌子上。每只小鼠在连续三次试验中进行测试。该行为使用0到2之间的等级进行评分。评分标准的示例如图二所示。若小鼠抬起头，弓起后背，伸手抓住桌子边缘，得2分。如果小鼠尝试但未能碰到桌子，则获得1分。没有任何反应的小鼠，得0分。在三次试验中平均得分有1分或1分以上的小鼠，认为具有视觉能力，可以继续进行研究。

图2：视觉能力测试得分标准。(A) 得2分，表示没有视力障碍；(B) 得1分，表示可能存在视力受损；(C)得0分，表示存在视力受损

4被动回避实验程序

1)适应：a. 实验人员在实验开始前抚摩小鼠三天，让小鼠适应抚摩，令其探索实验者的手1-2分钟，然后放回饲养笼；b.在实验开始前，小鼠提前运送到实验室，适应测试室30分钟以上。

2)分组：将小鼠随机分组，并且不同组的测试顺序也随机化。每个笼子中的小鼠分配到不同的实验组。进行实验的人对处理因素不知情。

3)清洁：在开始之前，清洁隔室地板和墙壁，将垫料放在地板下方的托盘中。

4)穿梭箱设置：选择一个安静的、光线昏暗的房间。测试室内的光照水平保持在40到70lx之间。设置回避程序所需的参数：1s为动物进入和释放电击之间的间隔，360s为最大试验持续时间，2s为电击持续时间，0.20mA为电击强度。在启动电击前，打开校准模式，并控制安培计，使实际释放的电击强度对应于期望的电击强度。

5)单次电击刺激训练：在训练程序中，将小鼠放在照明的隔室中，背对黑暗的隔室，并让它探索 30s。之后，升起两隔室之间的门，让动物自由活动。由于它们天生喜暗恶光，小鼠倾向于在几秒钟内进入黑暗隔室（通常为15 - 20s），测量穿梭的潜伏期。一旦动物所有四只爪子均进入暗室，连接门就会滑下来关闭，一次连续的 0.20 mA 电击将通过金属格栅地板传递 2s。惩罚后30s（以使动物将暗室和电击之间建立关联），将小鼠从黑暗的隔室中取出并将其放回饲养笼。用乙醇清洁设备，特别注意电击室（如果金属格栅未保持完全清洁，则电击强度可能会改变）。然后训练下一只动物。

6)记忆保持测试：测试程序可以在选择的时间点进行。通常，选择1小时和24小时间隔分别评估短期和长期记忆。在测试会话期间不会释放电击，因此在开始之前，请记住将电击强度值设置为零。将动物放入照明的隔室，头部背向连接门。10秒后打开门，让小鼠自由移动。测量进入暗室作为记忆索引的潜伏期。保留记忆的小鼠将避免进入接受受惩罚的隔室。截止时间设置为 360 s，之后连接门自动关闭，可以将动物从设备中移开。正常小鼠一般能够记住24小时前的在暗室中遭到的电击，因此通常不会进入暗室，即使进入了，也会具有很长的潜伏期。

7)数据分析：a. 通过独立样本 t 检验或单因素方差分析，然后进行适当的事后检验，跨组比较潜伏期数据；b. 以相同的方式检查初始潜伏期的差异，以控制感觉运动或动机的异常；c. 通过配对样本 t 检验，可以通过比较一组小鼠在测试试验中的潜伏期和在训练试验中显示的初始潜伏期来进行进一步的学习测试。相对于基础水平，潜伏期的显着增加表明小鼠有显着的学习；d. 通过为确定的类别设置阈值，例如学习者（> 55秒）和非学习者（< 55秒）或不良学习者（55到90秒）和好学习者（>90 秒），对潜伏期数据进行分类meta分析。不同类别小鼠的频率可以通过四格表中的卡方分析进行比较。

5主动回避实验程序

在主动回避任务中，通过将条件刺激（CS：光和/或听觉刺激）与非条件刺激（US：足部电击）相关联，训练受试者回避厌恶性US。在反复试验中，受试者了解到，为了避免足底电击（US），在出现警告提示（CS）时，它必须在隔室之间穿梭。通过分析测试期间的回避行为来评估学习表现。主动回避是一种广泛使用的经典条件反射范式，用于评估恐惧动机的联想学习和记忆。

1)穿梭箱维护：a. 每个测试日，应在每次测试开始前测试灯光和电击可以正常工作；b. 穿梭箱应在受试者之间清洁，尤其是隔室的地板。因为尿液的存在会增加动物经历的电击强度。

2)前期适应和分组同被动回避方案。在适应测试室30分钟后，开始了一天的测试，将小鼠轻轻地放置在穿梭箱的两个隔室之一中（右侧或左侧）。自由探索整个装置300 s（图3A），此时两个隔室都是黑暗的。在300s适应期后，作为条件刺激的房灯在没有小鼠的房间中呈现10s（图3B）。然后刺激控制器进行足部点击（0.1、0.2 或 0.3 mA，2 秒）（US）。有三种可能的反应：1）主动回避，小鼠在发生电击之前穿越到对面的安全隔室；2）逃跑（被动回避），动物在电击传递期间逃跑到另一侧；3）无反应：小鼠留在当前隔室接受2秒的电击没有其他反应（图3C）。一旦动物进入对侧的隔室，或者在总共12秒（CS的10 秒 + US 的2秒）后，光和电击都会消失，试验间隔（ITI）开始（图3D）。在ITI期间，小鼠可以在隔室之间自由移动30 ± 5秒。ITI结束后，将自动开始新的试验（即图3B）。

3)当小鼠完成后，放回饲养笼。

4)清洁每个小鼠之间的隔室地板和墙壁，以保持从地板释放的电击强度一致。

5)将下一个小鼠放入隔室并继续以上执行步骤。

6)连续5天每天总共50次试验。在每天的测试中，测试起始隔室不断交替。

图3：主动回避程序的分步示例

7)数据收集和统计分析：a. 行为分析软件会记录和收集以下数据：在300 s适应期间，记录动物在隔室之间穿越的次数。在测试阶段，将记录以下行为：主动回避、逃跑（被动回避）和无反应。使用每天成功主动回避电击的试验的百分比作为终点测量。还可以记录回避的潜伏期，即在提示灯（CS）出现后多长时间小鼠开始穿梭到对侧隔室。最后，在试验间隔期间，评估小鼠在两个隔室之间穿越的次数。穿越次数可以反应动物的运动情况；b.为了验证小鼠是否已经学会了主动回避反应，可以使用相关t检验来比较测试期间与训练期间主动回避反应的百分比。如果使用回避潜伏期作为学习指标，则可以使用相关 t 检验来比较测试期间与训练期间的潜伏期。但是，用于分析结果的统计测试通常基于人们试图回答的问题。如果一个人对实验操作（例如对小鼠使用不同的药物）是否会影响学习和记忆功能感兴趣，则可以使用具有重复测量的双因素方差分析来比较组间和测试日之间的差异，可以绘制学习曲线评估小鼠的学习能力，以测试日为横坐标，主动回避百分比或回避潜伏期作为纵坐标。此外，对测试结果进行多次比较的单因素方差分析可用于确定哪些实验组与未接受实验操作的对照组相比显示出显着差异。

实验讨论

1.确定动物之间在感知厌恶刺激方面是否存在固有差异很重要（基线水平差异），在足部电击的情况下尤其如此。例如，脑损伤会导致痛觉过敏。因此，验证主被动回避行为的第一步是评估足底电击响应的群体痛阈差异（方法参考：https:///10.1016/j.jneumeth.2020.108831）。同理，导致视力缺陷、镇静和运动功能紊乱的药物和基因操作均可能影响回避行为测试，从而产生假阳性或假阴性的结果。

2.在涉及使用电击的一系列行为测试中，小鼠应从应激和侵入性最小的实验到最大的顺序进行测试，并且应考虑每次测试之间的洗脱时间。例如，在测试认知能力的实验组中，顺序经常是Y迷宫，八臂水迷宫，然后再是主动回避。主动回避也可以是运动障碍动物的替代行为测试，例如动物不会游泳，则不能在水迷宫中测试MWM，而主动回避任务可以，只需要动物走一小段距离。

3.在被动回避任务中使用高电击强度有利于获得更好的表现。研究表明，电击的强度对小鼠学习主动回避任务的能力没有显着贡献，只有边际影响，一般情况下采用比较温和的电刺激。尽管在主动回避任务中，电击强度与表现之间缺乏直接相关性，但研究者仍然认为，在电击敏感性测试中看到的差异可能是群体水平上相关的混杂生物学变量。鉴于产生重叠学习曲线的电击强度范围很广，主动回避测试似乎仍然是一系列电击强度的可靠认知测试。如果在电击敏感度测试中发现明显的群体差异，我们不建议使用主动回避行为进行测试。

4.主动回避中一般选择光作为CS，听觉线索容易引起惊吓反应，小鼠在没有接受足部点击的情况下就可能穿梭。

5.研究表明每天接受50次试验的小鼠在第4天达到了80-90%的主动回避，并在第5天趋于稳定。因此每天50次试验，连续5天的训练安排较合适。

6.对于主动回避行为，第一天未能受到电击的小鼠应被排除在研究之外。此外，应评估高运动活性情况，因为这可能会影响对主动回避行为的解释。对于发现是实验组异常值的多动小鼠，应考虑排除。

7.研究表明，无论电击强度如何，雌性小鼠都比雄性小鼠更好地学习主动回避任务，这与先前对大鼠的几项研究一致，因此必须将性别视为主动回避任务中的重要生物学变量。

图4：性别对主动回避行为的影响。在低（0.1 mA、A-B）、中（0.2 mA、C-D）或高（0.3 mA、E-F）电击强度下，雌性小鼠在主动回避试验的比例和回避潜伏期方面均优于雄性小鼠

8.斑马鱼由于其世代时间短、每只雌鱼的产卵数量多、易于繁殖，在各种研究中已经成为一种有用的模式生物。主动回避任务也常用斑马鱼作为实验动物，实验设置和啮齿动物类似，实验方案可参考以下文献：DOI：10.1007/978-1-61779-597-8_20。

图5：斑马鱼穿梭箱

参考文献

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