脑声常谈｜动物行为实验指南：结合光遗传的三箱社交测试
通过社会互动和记忆而形成的社会关系对一个人的身心健康至关重要。迄今为止，三箱社交测试已被用来衡量啮齿类动物的社交接触、社交新奇性和社交记忆。近年来，包括光遗传学在内的技术发展迅猛，该技术用以急性控制特定神经元亚群的活动。最近的研究甚至将光遗传学与先进的时间基因表达控制系统相结合，在学习过程中标记特定的神经元群体，随后重新激活进行记忆测试。本文将光遗传学与三箱社交测试相结合，以检查在社会记忆编码或检索过程中涉及到的特定神经回路。首先，本研究用病毒编码的视蛋白立体定向地感染特定的大脑区域，这些视蛋白可以急性激活或抑制神经元的放电。随后让小鼠进行三箱社交，同时在社交记忆编码或提取过程中进行光刺激。光遗传刺激结合三箱社交测试是一个经过充分验证的行为学范式，用以探索不同的大脑回路在各种社会认知过程中的贡献。
关键词：社交接触，社交认知，社交记忆，记忆编码，记忆检索，光遗传学
背景
社会认知对人类心理健康至关重要。社会互动和记忆方面的缺陷是许多大脑疾病的显著特征。社会工作记忆是一个非常动态的过程，通常是不可预测的，需要对不断变化的刺激有持续的适应性。具体来说，这是一个涉及编码、存储和检索社会显著的信息的认知过程。传统的使用成像和损伤实验的人类和灵长类动物研究表明，内侧颞叶参与了包括社会认知和背景评估在内的社会认知任务。然而，先前的研究使用的毒素对大脑的许多区域造成了损害，并限制了对目标细胞类型和亚细胞部分的控制。最近使用急性光遗传学方法的研究表明，大脑的各种区域和回路，包括杏仁核、海马体和腹侧被盖区，在社会行为的不同方面发挥着包括调控社会互动、接触和社交记忆在内的关键作用。
为了研究特定大脑区域在社会记忆加工中的行为意义，研究者可以在一个经过充分验证的三室社交范式中评估受试小鼠的表现。在这个测试中，受试小鼠首先适应实验环境（第一阶段）。然后引入一只新的陌生鼠（S1）来评估记忆的形成和社交性（第二阶段），随后引入第二只新的陌生鼠（S2）来测试社会识别记忆和检索能力（第三阶段）。受试鼠对陌生鼠的探索时间会被记录下来。一般而言，野生型小鼠对陌生鼠2的探索时间显著高于陌生鼠1。因此，与光遗传靶向相结合，特定的神经回路可以在包括记忆形成（编码）或提取（识别）在内的各个阶段被激活或抑制。此外，光遗传学的使用还可以识别小鼠神经回路中可能参与调节社交能力和/或社会认知记忆的特定基因。
1、滤纸
2、多模光纤（0.39 NA，高OH，200 μm堆芯，波长范围：300-1,200nm；ThorLabs，目录编号：FT200UMT）
3、光遗传学实验材料（表1）
a.多模光纤（0.39 NA，高OH，200 μm堆芯，波长范围：300-1,200nm；ThorLabs，目录编号：FT200UMT）
b.1.25 mm陶瓷棒套圈，230μm（Precision Fiber Products，目录编号：MMFER2007C-2000)
4、注射套管（5 mm, 26 gauge; Plastics One,目录编号：C315GS-5/SPC）
5、1 ml注射器（BD科学公司，目录编号：309628）
6、Tygon管——I.D（内径）：1/16”（27mm）|O.D.(外径)：1/8"（3.175mm）|厚度：1/32”（0.9mm）（US Plastics，目录编号：57102）
7、铝箔（Alcan公司）
8、1.25 mm SM陶瓷分体套筒，长度为6.60mm（Precision Fiber Products，目录编号：SM-CS125S)
注：陶瓷分体套筒性能优于金属分体套筒，其纤维对准更精确。
9、1.25 mm套圈防尘盖（Precision Fiber Products，目录编号：BCDC-1300-W)
10、Parafilm M封口膜（Pechiney公司，目录编号：PM-996）
11、棉签（The Lab Depot公司，目录编号：394305)
12、C57BL/6小鼠（Jackson实验室，目录编号：000664）
13、AAV病毒（存储在-80°C，使用滴度为~10^11至10^13 pfu/ml）
14、牙科水泥（储存公司，目录编号：51458）
15、即时混合环氧树脂
16、缝合套件（伦理，目录编号：JJ489)
17、泪液凝胶
18、聚烯吡酮磺
19、生理盐水
20、70%乙醇
21、过氧化氢
22、镇痛药：美康（CDMV，5 mg/ml，每日1次，连续三天）
1.清洁片（Doric Lenses公司，目录编号：B600-0002)
2.纤维剥离工具（ThorLabs，目录编号：T12S21）
3.10 μl移液管（传感器，目录编号：90.1771.002)
4.数码卡尺（加拿大ULINE）
5.小鼠立体定位框架（上海欣软公司）
6.异氟醚麻醉系统（肯特科学公司，目录号：SOMNO-MSEKIT）
7.温度控制器
8.取暖电毯
9.外科手术工具，包括剪刀、钳子、手术刀（精细的科学工具）
10.0.6 mm钻头（目录号：78001）
11.双注射器输液泵（世界精密仪器公司，目录编号：SP200iZ)
12.10 μl气密注射器（汉密尔顿，目录号：84875）
13.白噪音机（Marpac）
14.光纤电缆，MM、200 μm、0.39 NA、FC/PC-FC/PC（Thorlabs，目录编号：M72L02）
15.光遗传学实验设备
a.473 nm DPSS激光系统（激光激光，目录号：R471003GX）
b.532 nm DPSS激光系统（激光激光，目录号：R531003GX）
c.函数/任意波形发生器（BK精度公司，目录编号：4052）
16.功率计，Si传感器，400-1,100nm，500 nW-500 mW（ThorLabs，目录编号：PM121D）
17.激光眼镜，180-532 nm（ThorLabs，目录号：LG3）
18.多立克迷你立方体（Doric mini cube，多立克镜头公司，目录编号：B340-0204)
19.2根单声道光纤接线插头（多立克镜头公司，目录编号：D202-2302)
20.45厘米宽，20厘米长，30厘米高的三室盒（上海欣软，中国）
21.直径8cmx17cm高的圆柱形钢丝笼（上海欣软，中国）
22.高压蒸气灭菌器
1、VisuTrack动物行为跟踪软件（上海欣软公司，400-833-6811）
A.光纤制备
1、使用光纤剥离工具剥离一段5 cm左右的多模光纤（直径200μm，0.39NA）（图1）。
图1|光纤测量（A.光纤的长度（以毫米为单位）取决于所需的目标区域。将光纤的长度（6.4 mm）和套圈与颅骨之间的间隙（0.5 mm）加到所需目标区域（表示为Xmm的Z坐标）。B.一个成品光纤外观）
2、使用切割刀切割一段剥离的多模光纤，使用数码卡尺测量长度[例如，长度= 6.4毫米（陶瓷套圈）+0.5毫米（套圈和头骨之间的差距）+所需的目标深度]（图2）。
图2|光纤结构（A.使用数码卡尺来测量长度。在本例中，目标区域的Z坐标为3.5 mm。因此，光纤的总长度为10.4 mm（3.5 mm + 0.5 mm + 6.4 mm）。B.使用切面刀切割适当的长度。C. 为了将光纤固定在陶瓷套圈上，在切割光纤的中间加入一滴环氧树脂。D. 将套圈推到环氧树脂滴上，将其固定在光纤上）
3、使用环氧树脂将切割纤维的一端固定在陶瓷套圈（孔径230μm，外径1.25mm）上。
4、让光纤干燥过夜。
5、植入光纤前对其高压灭菌。
6、确认每个光纤的透光率。每根光纤的激光透射率必须>75%才能用于植入。
B.手术准备
1.将注射套管连接到Tygon管的一端，另一端连接到1 ml注射器。
2.用移液管将所需体积（2μl/鼠）的病毒转移到一块封口膜上
3.用1 ml注射器缓慢抽吸，在注射套管中充满病毒。完成后，将注射器从Tygon管上取出。
4.将注射套管和胶管与病毒放在冰上，覆盖铝箔。
注：注射套管应在每只小鼠开始注射前填充病毒。带有病毒的管子在冰上保存最多1小时。病毒等应保存在干冰中。
C.病毒注射
1.将小鼠（4-6周龄）从笼中取出，术前放入未使用的笼子（单笼），等待15分钟。
2.将小鼠置于啮齿动物麻醉机的诱导室（4%异氟烷），等待3 min，直到小鼠呼吸稳定。捏脚趾，确保鼠完全麻醉。
3.将小鼠从诱导室转移到加热垫上（设置为37°C），并将麻醉面罩连接到鼻子上(2.5%异氟烷）。确保麻醉气体流速稳定，小鼠呼吸自然。
4.插入立体定位框架的耳杆，以确保鼠平行于框架的底板。在双眼中加入泪液凝胶（图3A)。
5.用棉签沾染70%乙醇清洗切口，然后用碘胺，最后用70%乙醇重复清洗。
6.用手术刀从前到后做一个水平切口，暴露颅骨并标记Bregma（图3A）。
7.用棉签上的过氧化氢干燥暴露的颅骨表面。
8.使用钻头根据病毒注射部位所需的双侧坐标（AP/ML）标记颅骨。
图3|双侧光纤植入的立体定向手术（A. 水平切口暴露颅骨。B.在植入之前，用AP/ML坐标固定在可移动臂上。C. 第二根光纤使用可移动臂进行双侧植入。D. 光纤被双侧植入。E. 双侧光纤用牙科水泥固定。）
9.将含有病毒的注射套管置入立体定位框架中，并确保其与气密注射器相连。
10.注射前，将输液泵以0.1 μl/min的速度连续注射，直到眼睛观察到病毒下降。
11.输液泵以0.1 μl/min抽出0.1 μl空气（在输液管尖端与病毒之间形成气泡）。
12.用注射套管重新测量所需的坐标（AP/ML）（注射套管应直接位于钻头产生的颅骨标记上方）。
13.降低输液管，直到其尖端接触到颅骨表面。
14.将输液泵以0.1µl/min的速度注入0.1µl。在注射过程中（之前从步骤C11中产生的气泡），轻轻地将注射套管降低到适当的DV坐标。
15.等待2 min，并编程输液泵以0.1µl/min的速度注入0.5µl病毒。注入后再放置5 min。
16.缓慢提起套管（~0.1 mm/s）。取出后，用乙醇清洗内部套管的尖端。确保尖端不被堵 塞，如需双侧注射，则重复步骤C10-C15。
D.光纤植入
1.病毒注射后，从立体定位框架上移除注射套管。确保带有病毒的注射管储存在冰上，并用箔覆盖。
2.使用钻头根据光纤所需的双侧坐标（AP/ML）标记颅骨。
3.将可移动臂连接到立体定向框架上，尖端固定一根光纤（图3B）。
4.用光纤重新测量所需的坐标（AP/ML）（光纤应直接位于钻头生成的颅骨标记上方）（图3B)。
5.将光纤降低至适当的DV坐标。用镊子轻轻剥下连接光纤与立体定向臂的链接。
6.使立体定向臂远离光纤。
7.重复步骤D3-D6（图3C)。
8.用牙科水泥固定两个光纤（图3d和3E）。
注意：在光纤基底部周围轻轻涂抹牙科水泥。保持光纤插入目标脑区，直到牙科水泥干燥。
9.缝合皮肤，清洁手术部位。注射适当的镇痛药，将小鼠放在加热垫上1小时。确保老鼠在放回新笼子之前完全恢复。手术后被单独安置以防止受攻击。至少7天监测术后健康状况（体重、水分状态、姿势/外观、面部表情和行为）。
E.三箱社交
1.术后恢复7天后，在实验前让受试小鼠在实验环境中适应10 min，持续 3天，一天一次。并通过陶瓷套管将光纤跳线连接到植入的光纤上。
2.准备2只幼年野生型陌生小鼠(3-4周龄，以防止战斗），按性别与受试者小鼠相匹配。
3.设置摄像机、照明设备(20勒克斯）和白噪声发生器（65 db）。
4.用70%的乙醇彻底清洗三室装置。将两个空笼子放在两侧腔室。
5.在测试前24小时，将每只链接光纤跳线的鼠进行3分钟的习惯期，然后在三箱社交设备内进行10 min的探索。在这两个习惯期之后，把老鼠放回到笼子里。
6.在测试前24小时，陌生鼠在笼子中也适应10 min（图4A）。
图4|三箱社交设备外观（A.用来放置陌生鼠的笼子。B.三箱社交设备内笼位的摆放）
7.在实验当天，使用功率计测试532 nm和473 nm激光器的强度（确保两个光纤跳线之间的功率输出一致）。
8.当准备好进行测试时，将小鼠头部光纤连接到光纤跳线（依次连接到波形发生器），并使其在笼内习惯3分钟，然后在三室设备的中间腔室进行额外的3分钟的习惯期。
9.移除隔板，让老鼠自由探索三个腔室10 min。
10.在习惯阶段之后插入隔板，同时确保受试小鼠回到中心腔室1 min。
11.将第一只陌生鼠放入两个空笼子中的一个。
12.再次移除隔板，并允许受试鼠自由探索三室5 min。嗅探笼子里的陌生鼠和嗅探另一个空笼的时间通过视频跟踪系统手动记录下来。在这个社交阶段，光遗传学可测试目标神经回路在社会记忆编码中的作用。例如：
a.对于表达ArchT的小鼠：双侧给予532 nm（15 mW和~119.43 mW/mm^2）的绿色灯光，持续5 min。
注：可根据不同的脑区进行相应的调整功率。
b.对于表达ChR2的小鼠：双侧给予473 nm（20 Hz，5 ms脉冲宽度，6.5 mW和~51.75 mW/mm^2）蓝光30 s点亮，然后30 s熄灭模式5 min。
注：脉冲频率/持续时间可根据不同区域进行相应调整。
13.在社交阶段之后插入隔板，同时确保受试者小鼠回到中心腔室1 min。
14.把第二只陌生鼠放到另一个空笼子里。
15.移除隔板，允许受试鼠再次自由探索三个腔室5 min。嗅探新的陌生鼠和熟悉的陌生鼠的时间通过视频跟踪系统手动记录下来。在此社会认知记忆阶段，光遗传学操作可用于测试记忆提取能力（参见步骤E12中的ArchT和ChR2条件）。
16.在测试之后，受试鼠回到中间腔室，随后放回一个新笼子内。
数据分析
1、所有的测试阶段都被顶部摄像机记录并自动分析。受试小鼠的鼻子或身体与笼内陌生鼠距离低于2厘米时的嗅闻时间/直接接触次数将被记录，通过人工操作来记录社交时间/次数。攀爬铁丝笼的动作应排除在评分之外。社交参数以社交偏好（%）表示（图5）。
图5|三箱社交的区域分析和数据分析.（A.三箱社交装置中的区域划分。B.计算在左侧或右区域探索所花费的时间百分比，分母为两个区域的停留时间总和）
2、图中所有数据均以平均值±标准误（mean ± SEM）表示，并采用独立样本t检验、配对样本t检验或方差分析进行统计学评估，随后进行事后Holm-Sidak的多重比较。P < 0.05视为显著性差异（*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001）。
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