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脑声常谈：行为学试验因素

萌宠菠菠乐园
2024-08-25 05:38

不同的饲养环境及设施条件会对相同品系的实验动物产生不同的影响。有许多因素可影响动物对光照的需求,在确定室内饲养动物照明水平时应当注意这些因素,其中包括光照度、光线波长、光照时间、动物的光照经历、动物的体表色泽、昼夜节律、动物的体温、激素水平、年龄、种类、性别和品系等。很可能光照、食物、水以及温度等因素都影响实验动物大小鼠的繁殖,但在这些变量中光照条件最难控制,也最容易被忽视。

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哺乳动物的昼夜节律系统受生物钟调控，生物钟是由核心生物钟基因构成的转录翻译反馈环。小鼠体内几乎每一个细胞内都存在生物钟，实现昼夜节律的调控。生物钟基因缺失或突变能够导致小鼠生物钟的紊乱，行为学上可以观察到内在节律丧失、周期偏离正常范围，而这些突变小鼠分别有睡眠、代谢、生殖、肿瘤等不同的表型，提示了生物钟基因或生物节律的改变与疾病有密切的关联。由于光线是昼夜节律系统中最有力的授时因子，光照对昼夜节律系统的同步是普遍存在的现象。对于小鼠来说，光照是影响昼夜节律变化的最重要环境因素，可以重置小鼠的昼夜节律，通过牵引作用实现小鼠昼夜节律与外界环境同步。在现实生活中，跨时区飞行、季节性日照时间的改变，都是外界光照对机体昼夜节律牵引的现象。许多基因突变小鼠都表现出适应外界光照变化能力的改变。光线还可以直接对小鼠的活动起到抑制作用(masking)。机体对光照的响应很大程度上依赖昼夜节律系统，因此人们通常可以利用不同的光照周期、光照时间点、光照强度来检测小鼠昼夜节律系统对于光线的响应，记录小鼠的行为变化，进而分析某些基因的缺陷是否对生物节律产生影响。

光照时间及昼夜节律对大小鼠繁殖的影响：

哺乳动物的生理和行为都受到下丘脑视交叉上核相关的中枢及外部生物钟控制系统调节,该系统是由视网膜感知光信号从而调节昼夜节律,昼夜节律时钟系统整合到下丘脑-垂体-性腺轴中,调节激素基因表达、激素分泌以及生殖系统中的生物节律。松果体分泌的褪黑素(melatonin)在该过程中起到关键的作用,褪黑素的分泌呈昼夜变化,暗周期中分泌较多,作用于下丘脑并抑制垂体释放促性腺激素。光周期中褪黑素分泌少,可促进促性腺激素的分泌。许多野生动物、家养动物及实验动物,都是季节性繁殖动物,这意味着它们的繁殖状态取决于光照的持续时间以及由此产生的褪黑素。昼夜节律紊乱的鼠能够有规律的交配周期,但是其中一些是不育的(如BMAL1KO小鼠),这就是说对于多数近交系小鼠而言光照不能直接通过影响褪黑素的分泌调节其生殖,但能够通过影响昼夜节律而间接影响其繁殖性能。不同品系的大小鼠对于光照长度也有不同的适应性,有研究指出半屏障系统内每天给予KM小鼠14h光照,其体质量和部分生殖器官重量以及雌鼠繁殖能力都明显高于10h光照组。也有数据显示8和12h光照长度裸鼠的平均育成率和离乳育成率均高于16h光照组,而不同的光照长度对裸鼠生长发育无显著影响,因此作者认为中光照和短光照更加适合裸鼠的繁育。而对大鼠的研究则显示,神经系统完好的SD大鼠(30~110日龄)暴露在8h/d和16h/d的光照下,其生殖系统、交配行为和后代数量不受光照暴露时间的影响,但短光照组大鼠的体质量、睾丸、精囊重量及血浆睾酮水平显著降低,这表明过短的光照可能影响大鼠的生长发育。对于长期饲养的种群来说,这也可能影响后续的生殖器官等性状的遗传,不利于种群的质量保持。

因此在动物繁育设施中有条件做到不同品系分开不同的房间饲养时,可以将房间的照明节律按照不同品系的最适节律来进行调整,以保证繁育的最佳状态。

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小鼠昼夜节律检测方法

代谢笼检测小鼠昼夜节律

代谢笼由检测活动、食物、水、氧气含量和二氧化碳含量等检测模块和数据记录、数据储存等模块组成的一套实验动物监测系统。该系统可以连续实时记录小鼠活动、进食、饮水、氧耗量和二氧化碳产生量。本文以Slc7a11tm1a/tm1a突变小鼠和野生型小鼠为例，使用代谢笼系统(Coulumbus Instruments,CLAMS)。用代谢笼检测小鼠活动和饮食昼夜节律过程的具体操作如下：将小鼠单独放置于代谢笼的笼盒内，前3d为适应阶段，从第4d开始记录，第4d至第6d每隔20min记录小鼠活动、饮食和饮水数据，连续记录3d。适应阶段以及记录阶段小鼠所处环境皆为正常饲养环境，光照周期为标准光照周期(8:00开灯，20:00关灯)。

跑轮检测小鼠内在昼夜节律周期

小鼠跑轮活动由生物节律监测系统记录，与代谢笼相比，跑轮记录是检测小鼠活动昼夜节律的经典设备，可以长期检测小鼠活动的节律，被广泛运用于异常小鼠昼夜节律的筛选，发现了一系列昼夜节律异常的突变体。实验过程中，将小鼠单独放置于带有滚轮的笼盒中，在笼盒中小鼠自由获得食物和饮水。笼盒与记录仓相连，每个记录仓可以单独调节光照周期以及光照强度。小鼠在滚轮上每跑动一圈，记录仓便记录一次数据。跑轮检测小鼠内在昼夜节律周期的具体操作过程如下：将小鼠单独放置于带有滚轮的笼盒中并置于记录仓中与记录系统连接。小鼠在标准光照环境中(8:00开灯，20:00关灯)牵引7~10d，使得每一只小鼠的昼夜节律被外界光照稳定牵引。接下来关闭灯光，环境灯光变为持续黑暗，并至少记录14d。因为外界环境恒定，不存在影响小鼠内在昼夜节律的外界因素，所以持续黑暗中小鼠跑轮结果反映了小鼠内在的节律(free running)。随后根据跑轮记录到的小鼠在持续黑暗下活动可以计算得到小鼠的内在节律周期。周期可以根据在持续黑暗中小鼠跑轮活动的斜率计算得到，持续黑暗中小鼠昼夜节律的周期反映了小鼠内在生物钟的快慢。

倒时差实验

为检测小鼠适应外界环境昼夜变化的能力，通常使用倒时差实验来检测小鼠被重新牵引的能力。倒时差实验具体操作步骤为：将小鼠单独放置于带有滚轮的笼盒中并置于记录仓中与记录系统连接，首先小鼠被置于标准光照环境中(8:00开灯，20:00关灯)7~10d，使得小鼠昼夜节律被稳定牵引；随后将开灯时间周期前移，如：2:00开灯，14:00关灯，模拟向东跨6个时区飞行。小鼠倒时差后驯化天数是视小鼠适应时差的天数而定(在完全适应新灯光后再驯化固定天数)。在小鼠跑轮活动被稳定牵引后，再将开灯时间后移，如：8:00开灯，20:00关灯，模拟向西跨6个时区飞行。分别测量小鼠在2次倒时差过程中的起跳点时间的变化，来说明小鼠适应新时区的快慢，反应小鼠被再次牵引的能力。随后根据小鼠完全适应新时区所需要的天数来反应适应环境变化的能力。

长光照与短光照实验

通常使用长光照或者短光照来反应小鼠适应季节性日长变化的能力。在实验中，小鼠被置于标准光照环境中(8:00开灯，20:00关灯)7~10d，使得小鼠昼夜节律被稳定牵引。然后，将光照时长改变，如：光照时间改为18h，黑暗时间为6h(5:00开灯，23:00关灯)，在小鼠跑轮活动被稳定牵引后，再恢复到标准光照环境(8:00开灯，20:00关灯)中。此外，还可以通过调节开关灯时间来缩短光照时间，探究小鼠适应短光照的能力。随后根据小鼠在长光照或者短光照下的活动时长来反映小鼠适应季节性日长变化的能力。

骨骼光周期实验

骨骼光周期实验就是用来检测外界光照对小鼠活动的牵引能力。在实验中，小鼠首先被置于标准光照环境(8:00开灯，20:00关灯)中7~10d，使得小鼠昼夜节律被稳定牵引。然后，将光照条件调为持续黑暗，只在标准光照对应的开灯和关灯时间点给与很短的光照脉冲，最大程度地减少在实验过程中光照对小鼠活动的抑制作用，光照周期应该尽量接近小鼠内在节律的周期，如：8:00~8:15和19:45~20:00开灯，光照周期为24h，其余时间保持黑暗。根据稳定牵引的定义，首先计算小鼠在骨骼光下的活动周期，是否和外界光照周期一致。然后，判断每个周期内小鼠活动的相位和光照的时间点关系是否稳定。根据这两个条件判断小鼠是否可以被外界光照稳定牵引。在稳定牵引的基础上再比较实验组和对照组小鼠活动的相位，如活动起跳点，说明两种小鼠活动相位的差异。

T7-cycle实验

光照除了可以重置小鼠活动的相位，实现对小鼠活动昼夜节律的牵引，还可以直接抑制小鼠的活动，减少小鼠的活动量。因此，在检测光照对小鼠活动量的抑制能力时，要尽可能排除光照的牵引作用。T7-cycle是检测光照对小鼠活动抑制的常用方法。在实验中，光照条件设置为3.5h开灯，3.5h关灯，以此循环往复。此过程中，光照周期是7h，与小鼠昼夜节律周期差距较大，且非24h的约数，所以小鼠的昼夜节律不能被7h光照周期牵引，实验结果最大程度上反应了光照直接对小鼠活动抑制作用。实验过程中小鼠被置于T7-cycle光照条件下至少7d，因为在7d的实验过程中各个7h的时间窗口都会经历3.5h光照~3.5h黑暗的光照变化。随后通过统计小鼠的活动量来评价光照对小鼠活动的抑制作用。