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北桑寄生总黄酮对斑马鱼急性肝损伤的保护作用

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2026-02-20 06:03

急性肝损伤（acute liver injury，ALI）是由无肝病或患有肝病但处于稳定状态的人员在受到长期熬夜、大量酗酒、肝脏缺血缺氧及药物中毒等因素所致。随着医学技术的发展，越来越多的研究者发现 ALI 的发生发展与炎症反应、氧化与抵御氧化系统失衡及铁死亡等密切相关。肝脏损伤进一步恶化，会发展为更为严重的衰竭，诱发机体免疫能力下降、血糖含量异常、脂质代谢紊乱等异常现象累及其他器官损伤。目前，ALI 的临床防治主要采用保肝药物进行治疗，严重者会选择肝脏替代治疗。

北桑寄生 Loranthus tanakae Franch. et Sav.是桑寄生科桑寄生属落叶灌木，寄生对象为栎属、桦属、李属等树木，在中国、日本、韩国、朝鲜等均有分布。现代研究表明北桑寄生中含有糖类、甾体皂苷类、黄酮类等次生代谢物。其中黄酮类化合物在北桑寄生药材中含量丰富（约 10.58%）。目前，北桑寄生的药理活性研究较少，还尚未见北桑寄生在治疗 ALI 方面的研究报道。课题组前期研究显示，北桑寄生总黄酮（total flavonoids of L. tanakae，LTF）具有良好的抗氧化作用，可以促进脂多糖诱导的RAW264.7细胞中 Nrf2 转录活性，抑制炎症反应的发生。因此，本研究利用硫代乙酰胺（thioacetamide，TAA）建立斑马鱼 ALI 模型，对北桑寄生中黄酮类化合物的保肝活性进行研究，以期为北桑寄生的药理研究提供科学依据。

实验方法

LTF 含量检测：配制芦丁对照品溶液，绘制回归方程。称取实验室自制的 LTF，配制成质量浓度为 1 mg/mL 的溶液，使用三氯化铝-醋酸钠溶液显色，利用回归方程计算 LTF 的含量。

LTF 对 TAA 诱导的斑马鱼肝损伤的影响：斑马鱼荧光肝脏分析选取具有荧光标记的 3 dpf Tg（-1.7apoa2:GFP）转基因斑马鱼幼鱼于 6孔板内，设置对照组、模型组、阳性药 NAC（10 μmol/L）组和 LTF（12.5、25.0、50.0 µg/mL）组，每孔 15 尾。对照组给予斑马鱼养殖水，模型组加入7 mmol/L TAA 溶液，各给药组给予 7 mmol/L TAA 和相应药物，给药处理 72 h。给药结束后，斑马鱼用三卡因麻醉，置于载玻片上，使幼鱼两眼重叠，用荧光显微镜采集同一体位图像，使用 Image J 软件统计幼鱼的荧光肝脏面积。

LTF 对斑马鱼的耐受性考察：将 3 dpf AB 斑马鱼暴露在不同质量浓度的 LTF 溶液中，每 24 小时观察记录幼鱼的存活情况。如图 1 所示，当 LTF 质量浓度为 50 μg/mL 及以下时，幼鱼未出现出明显的发育、形态、行为异常。随着 LTF 质量浓度增大至 100 μg/mL，有 3.3%幼鱼开始死亡。 LTF 质量浓度大于 200 µg/mL，少量幼鱼出现脊背弯曲与游泳转圈等异常行为，死亡现象较为明显。斑马鱼给予 200、400、800 µg/mL LTF 处理 24 h 的生存率分别达到 83.3%、20.0%、0。400、800 µg/mL LTF 处理幼鱼 48 h，幼鱼大量死亡。因此将后续实验 LTF 剂量控制在 50 μg/mL 及以下。

利用肝脏荧光标记斑马鱼 Tg（-1.7apoa2:GFP）测定斑马鱼的荧光肝脏面积与荧光强度，考察 LTF 能否改善 TAA 诱导的斑马鱼肝损伤。如图 2 所示，与对照组比较，经过 TAA 处理的斑马鱼幼鱼，其绿色荧光肝脏面积明显减少（P＜0.01），绿色平均荧光强度下降（P＜0.01），肝脏形态发生改变。与模型组比较，NAC 显著增加幼鱼的荧光肝脏面积和荧光强度（P＜0.05、0.01）；12.5～50.0 μg/mL LTF 可以有效逆转 TAA 诱导的肝脏面积萎缩（P＜0.05、 0.01），25.0 μg/mL LTF 也可显著逆转肝脏荧光强度（P＜0.01）。

图 2 LTF 对 TAA 诱导的斑马鱼肝脏发育的影响 ( x ± s , n = 15)

AST 和 ALT 活性是反映肝脏损伤的重要因素，肝脏遭受某些刺激或损伤时，AST 与 ALT 活性异常上调。如图 3所示，将斑马鱼暴露在 TAA 溶液中连续处理 72 h，幼鱼体内 AST 与 ALT 活性显著升高（P＜0.01），说明幼鱼肝脏出现损伤。与模型组比较，NAC 组和 LTF（25.0、50.0 µg/mL）组 AST 与 ALT 活力显著降低（P＜0.05、0.01）。

图 3LTF 对 TAA 诱导的斑马鱼肝功能的影响 ( x ± s , n = 3)

LTF 在斑马鱼模型上显示了肝保护作用。在本研究中，LTF 可以明显逆转 TAA 诱导的斑马鱼生长发育迟缓、卵黄囊吸收滞后，在一定程度恢复了肝脏病理结构，增加了肝脏面积及荧光强度，改善了肝功能酶活性。LTF（25.0 µg/mL）组的效果比较明显，当剂量增加至 50.0 µg/mL 时，个别指标（如组织病理、肝脏荧光强度）并未显示出显著性差异，可能是由于 50.0 µg/mL 接近毒性剂量，引起了斑马鱼发育的异常，这也提示在后续的研究中，将深入探究 LTF 的量效关系以及潜在的毒性。本研究首次揭示了 LTF 对 ALI 具有明显改善作用，为后续深入研究提供了有益探索。

LTF 通过降低中性粒细胞的迁移现象缓解肝损伤。现代研究表明 TAA 在诱发氧化应激反应后，进一步促进炎症介质肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL6）等释放，激活炎症。在本研究中，TAA 处理幼鱼后，幼鱼卵黄囊附近出现大量中性粒细胞聚集，提示局部的炎症发生。25.0、50.0 µg/mL LTF 干预后，中性粒细胞迁移现象减少。研究结果进一步说明LTF可能通过减少中性粒细胞的聚集现象来改善 TAA 引起斑马鱼的局部炎症。

结论：

综上，本研究首次发现 LTF 对 TAA 引起的肝毒性具有抑制作用，并通过维持氧化与抗氧化系统的平衡来减轻肝脏损伤，为后续深入探讨其作用机制奠定了基础。

参考文献：

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［5］北桑寄生总黄酮对硫代乙酰胺诱导斑马鱼急性肝损伤的保护作用，邓丹丹 1，赵博荣 1，颜丽涵 1，周江韬 1，王松松 2，杨虹 1，杨飞 1，杨官娥 1*，韩利文 2*