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斑马鱼行为篇㊴：斑马鱼肝纤维化模型

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2024-09-23 20:03

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啮齿动物模型已被广泛应用于HF研究中，但其存在养殖成本高、实验周期长、无法进行药物高通量筛选等问题。即使是在啮齿动物肝病研究技术已经成熟的条件下，单一的动物模型也不能概括人类肝疾病的各个方面。因此，结合多种动物模型更有利于理解HF疾病。斑马鱼是一种被广泛用作生理学、毒理学及分子遗传学研究的脊椎类模式动物。利用斑马鱼建立肝纤维化(hepatic fibrosis，HF)模型既具有实验周期短、成模效率高、造模费用低等优点，又具有啮齿类动物实验可比度高、预测性强等优势，可以有效地弥补体内和体外实验之间的巨大生物学断层。

斑马鱼HF模型诱导方法

目前，建立斑马鱼HF模型的方法主要有:向养殖水中加入诱导药物、饲喂高脂饮食(high fat diet，HFD)、应用转基因技术等，所建立的HF模型都具有良好的稳定性和重复性。

酒精诱导斑马鱼HF模型

斑马鱼通过直接浸泡在含有乙醇的养殖水中完成HF造模，可以避免饲喂过程中动物因饲料采食不均而出现成模差异。雌性斑马鱼对乙醇的敏感性会随暴露时间增长而增加，故多选择雄性斑马鱼进行实验。斑马鱼暴露于1%乙醇8周或0.2%乙醇4周后，肝出现炎症因子浸润、ECM蓄积等HF阶段特征。与野生型斑马鱼相比，使用甲硝唑(metronidazole，Mtz)/硝基还原酶(nitroreductase，NTR)系统构建的基因工程斑马鱼经过乙醇处理会显著加快HF进程。斑马鱼幼鱼在4hpf就可以代谢酒精，且此过程中所涉及的基因在幼鱼中是高度保守的。有研究建立了斑马鱼幼鱼先天性糖基化障碍Ⅰb型(MPI-CDG)模型，并指出发育早期MPI消耗可以驱动HF发生。用2%乙醇处理上述转基因斑马鱼，观察到纤维化相关基因表达上调，而调节甘露糖代谢途径可以实现对HF的抑制。但在乙醇诱导的斑马鱼体内，未观察到晚期HF和肝硬化病理变化，因此上述模型更适合早期HF研究。

高脂饮食诱导斑马鱼HF模型

高脂饲喂转基因斑马鱼2个月后诱导HF的发生。岩藻依聚糖(OF)治疗或高脂饮食后运动(high-fat diet plus exercise，HEX)可以有效缓解成鱼的HF。Turola等通过研究更年期与HF的关系时发现，卵巢分泌的雌激素对HF具有抑制作用，卵巢衰老会加速HF形成。小鼠可以通过卵巢摘除手术诱发HF，而斑马鱼随着卵巢的衰老也会发生HF，这是一种类似于人类的自发过程。

化学药物诱导斑马鱼HF模型

硫代乙酰胺(thioacetamide，TAA)TAA在肝中转化为硫氢化合物诱导肝细胞膜损伤，进一步导致肝细胞坏死。此模型更适合早期肝硬化的研究，当增加给药剂量或延长实验周期可诱发急性肝衰竭(ALF)和HCC。

成鱼每周3次腹腔注射TAA(300mg/kg)，连续6周显示造模成功。研究发现幼鱼经TAA浸泡处理后肝内可出现与腹腔注射TAA相似的脂肪变性和胶原纤维沉积现象。使用25～50μmol/L的山奈酚-3-O-芸香糖苷治疗后，α-SMA和Collagen-I基因表达显著下调，提示山奈酚-3-O-芸香糖苷具有HF治疗药物的潜力。二乙基亚硝胺(DEN)DEN为水溶性物质且理化性质稳定，可直接水浴给药。浓度范围为150～200mg/L，常用浓度为200mg/L，4～6周可获得稳定的斑马鱼HF模型。Ⅰ型胶原纤维的大量沉积被认为是HF发生的标志，牛大力水提物及一些新型抗HF药物均可通过抑制胶原纤维合成减轻HF。溴化聚苯乙烯(BPS)BPS与DEN类似，更倾向于导致脂质代谢紊乱引起斑马鱼HF。研究表明，BPS能促进脂肪在血管内壁和肝中蓄积。短期BPS暴露后，给予90d的净化期，肝脂质积累得到恢复。若幼鱼长时间暴露于BPS，使肝内未折叠蛋白反应(UPR)被激活，导致雄性斑马鱼肝中三酰基甘油过量积累，逐渐发展为HF。斑马鱼肝细胞组成成分与哺乳动物相似，但肝缺乏小叶结构，导致幼鱼肝中ECM蓄积与人类和啮齿动物不同。

遗传操作斑马鱼HF模型

HBV/HCV转基因斑马鱼丙型肝炎病毒(HCV)宿主范围极窄，建立动物模型比较困难。转基因斑马鱼的出现就很好地解决了这个难题。通过显微注射pFL-GIC(HCVIＲES介导核心蛋白Core表达)和pFL-5AiR(含有HCVNS5A的表达质粒)构件显示，Core与NS5A协同上调Tgf-β的转录水平，促使HSC转化为MFB，分泌大量ECM，产生纤维化作用。在维生素B12处理后，HCV转基因斑马鱼肝内Tgf-β和乙酰肝素酶等HF标志物表达下调，表明维生素B12对HF有一定的抑制作用。临床上乙型肝炎病毒(HBV)/HCV合并感染比单一病毒感染更易引发HF和肝硬化。1月龄HBx+HCP转基因斑马鱼肝细胞已发生气球样变、胆管扩张及HF等。

1、β-catenin转基因斑马鱼：

在慢性或严重肝损伤时，肝祖细胞(LPCs)增殖分化为肝细胞或胆管细胞参与肝再生。但研究表明，LPCs的数量往往与肝疾病的发展程度成正比。此外，LPCs还会分泌促炎症细胞因子，故长期存在会加剧炎症和纤维化。Tg(fabp10a:pt-β-catenin)s704，该模型可在肝细胞特异性启动子Fabp10a作用下促进肝细胞出现DNA损伤和凋亡，受损的肝细胞还可引起炎症、LPCs活化以及HF，通过抑制EGFＲ-EＲK-SOX9轴可促进大量的LPCs向肝细胞分化，参与受损肝的修复。

2、Sox9b基因敲除突变体：

胆汁淤积是由多种肝内和肝外淤胆原因导致胆汁分泌或排泄障碍，伴随着胆管细胞和肝细胞损伤，最终导致ECM在肝内过度蓄积。胆管结扎术BDL)是建立小鼠和大鼠胆汁淤积性HF模型的方法之一，但应用该方法建立的HF模型死亡率较高，且不适用利胆药物的作用评价。Sox9基因主要表达于胆管细胞，在慢性肝损伤时，肝细胞内的Sox9基因表达上调。与人类和小鼠不同，斑马鱼基因组存在两个Sox9同源基因，分别为Sox9a和Sox9b。4dpf斑马鱼肝部位具有较强的Sox9a/b基因表达信号，sox9bfh313基因突斑马鱼在5mpf，由于胆汁淤积使得肝和胰腺均出现纤维化样病变。

3、MicroRNA-21(miＲNA-21)转基因斑马鱼：

MicroRNA-21(miＲNA-21)转基因斑马鱼在6mpf，可明显观察到肝细胞内的胞质透明包涵体(MDBs)增多并伴随炎症和HF的发生。如同时用DEN处理3～9个月，会加快HF的发生和发展。与单一化学试剂法相比，使用转基因技术和DEN联合处理可以大大缩短实验周期。

4、Tol2转座子介导的转基因斑马鱼：

内皮素(endothelin，ET)来源的主要场所为肝，在ET的3个蛋白质家族(Edn1、Edn2、Edn3)中，Edn1基因具有调控炎症反应和脂肪细胞分化的作用。HSC的活化被认为是HF发生的核心，而肝内ET的受体也位于HSC上。edn1转基因斑马鱼在3～11mdp，肝内胶原纤维表达逐渐增高。上皮细胞通过上皮间质转化(EMT)转化为MFB最终参与HF。研究发现，Dact2基因缺失会加速EMT。使用两种转基因斑马鱼研究极光激酶A(AuroraA)在肝中的作用，发现AUＲKA(V352I)转基因斑马鱼早于AURKA(WT)转基因斑马鱼2个月发生HF，在5～7mpf两种转基因鱼肝中Ctgfa和Hpse基因的表达上调，并逐渐进展为HCC。对于小鼠转基因模型来说，即使经过长期诱导肝癌发生率仍然较低。由此可以看出，斑马鱼比小鼠更为敏感，更适合人类肝疾病模型的建立。

5、Tet-off/Tet-on调控系统：

HF程度常常与HCC进展呈负相关，即在HCC早期HF标志物表达上调，晚期则出现下调的趋势。7～12月龄Gankyrin转基因斑马鱼会自发胆管炎、肝脂肪变性、HF、HCC等一系列病理变化。有研究经免疫染色发现，KrasV12转基因斑马鱼肝内CollagenⅠ和层粘连蛋白大量沉积、活化HSC的比例显著增加。加入西仑吉肽后，转基因斑马鱼HF指标明显降低。在上述HF模型中，药物造模应用时间较早，虽然有一定的成功率，但其缺乏统一的操作标准使得造模成功率不同。HF的发生是一个缓慢进程，药物诱导模型可以更全面地复刻人类HF各个阶段的特征病变，但药物相加作用及不同药物作用机制的不同，药物HF模型对药物开发也存在一定的局限性。近些年，由于技术手段的不断创新，研究人员已经通过修改斑马鱼的基因组，来实现特定基因在肝部位的可控表达，并且在除去诱导因素后，基因在肝部位表达随之减弱，引发的肝病变也会停滞。同时，部分转基因斑马鱼后代可以稳定自发形成HF且会快速进展为HCC，因此转基因HF模型更适合研究HF发病进程的机制及药物开发。

参考文献：

新型PPAR双重激动剂F3SM和胆宁片治疗实验性斑马鱼肝纤维化的研究[D]. 赵静.北京中医药大学,2019

王洁,冯驰,董武,等.斑马鱼肝纤维化动物模型研究进展[J].中国实验动物学报,2023,31(04):531-540.

One Host-Multiple Applications: Zebrafish (Danio rerio) as Promising Model for Studying Human Cancers and Pathogenic Diseases[J]. Dudziak Karolina;Nowak Michał;Sozoniuk Magdalena.International Journal of Molecular Sciences,2022

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