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斑马鱼行为篇㊳：斑马鱼听觉功能研究

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2024-09-15 15:14

斑马鱼是研究听觉的良好模式生物，可通过成像实时跟踪观察斑马鱼各种组织器官的发育过程，其内耳及侧线神经丘中的毛细胞与哺乳动物内耳毛细胞相似性较高，影响斑马鱼毛细胞功能的相关基因常为耳聋基因，同时斑马鱼还便于通过行为学特征分析其听觉功能。因此作者通过斑马鱼研究ARCN1在机体内的空间表达与其对听觉器官发育及听觉功能的影响。斑马鱼中ARCN1的同源基因为arcn1a和arcn1b，arcn1a编码的蛋白长度为509个氨基酸，arcn1b编码的蛋白长度为512aa，它们的氨基酸相似性超过80%，选取其中较长的arcn1b做进一步研究。

AB品系野生型斑马鱼和毛细胞带有绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的转基因斑马鱼Tg（Brn3c：GFP），饲养条件为28℃，14h光照/10h黑暗循环。斑马鱼胚胎，性成熟的斑马鱼杂交产卵后立即采集受精卵，加入E3培养液在28.5℃条件中培养，为避免胚胎色素沉着，受精后20h（hour post fertilization，hpf）左右将E3培养液更换为含有0.003%苯基硫脲的E3培养液，此后每24h更换新鲜含苯基硫脲的E3培养液。所有动物实验均按规范设计。

斑马鱼全胚胎原位杂交

利用特异性引物从斑马鱼cDNA文库中扩增出500个碱基对（base pair，bp）左右的目的基因cDNA片段，并将其连接到pGEM-T-easy载体中，引物序列见表1。将成功连接的pGEM-T-easy载体线性化后使用DIG RNA labelingkit试剂盒合成地高辛标记的目的基因反义探针。收集不同发育阶段的斑马鱼胚胎，剥去胚胎绒毛膜后，使用4%多聚甲醛（paraformaldehyde，PFA）在4℃固定过夜。对胚胎进行梯度脱水、梯度复水和蛋白酶K消化处理后加入特异性探针。经过特异性探针孵育过夜后，使用Anti-Digoxigenin-AP孵育过夜，最后使用NBT/BCIPsolution进行显色。

吗啡啉注射

GeneTools合成了对arcn1b基因特异的剪接阻断Mo（5'-AGTTCAAACGCTCATACCTGACTGA-3'）。Tg（Brn3c：GFP）斑马鱼自然交配以获得用于显微注射的胚胎。Mo用无核酸酶水（rnase free water）稀释至0.3mol/L并注射到一细胞阶段的胚胎中，构建arcn1b基因敲低的斑马鱼模型，然后在28.5℃的E3培养基中培养后进行拍照成像。

构建arcn1b基因敲低斑马鱼模型

A：斑马鱼胚胎注射示意图；B：Mo显著下调72hpf斑马鱼arcn1b表达

声音惊吓反射

将20条斑马鱼幼鱼放入连接有振动器的培养皿中。幼鱼对振动器产生的声音刺激（9 dB re.ms–2,600 Hz,30 ms）产生响应，培养皿上方的红外摄像机自动记录声音刺激后6s内斑马鱼的运动状况。平均移动距离和峰值速度用于量化惊吓反应。斑马鱼内耳负责听觉功能，为了探究arcn1b对斑马鱼听觉功能的作用，对arcn1b缺失斑马鱼进行了声音惊吓反射实验。通过对一细胞期的斑马鱼胚胎注射Mo敲低arcn1b，在斑马鱼发育到受精后第5天（day post fertilization，dpf）时，进行听觉行为检测显示，与对照组相比，敲低arcn1b导致斑马鱼经声音刺激后的运动距离和峰值速度显著降低，表明arcn1b缺失导致斑马鱼听觉功能异常。

arcn1b缺失导致斑马鱼听力损失

A：声音惊吓反射实验设备示意图；B：对照组和arcn1b基因敲低组斑马鱼游泳轨迹图；C：对照组和arcn1b基因敲低组斑马鱼应对声音惊吓的游泳速度；D：对照组和arcn1b基因敲低组斑马鱼应对声音惊吓的游泳距离

斑马鱼胚胎arcn1b缺失导致支持细胞的增殖能力下降，从而减少支持细胞、毛细胞及毛细胞簇数量，最终影响斑马鱼的听觉功能，而这些异常可能是由于arcn1b缺失导致内质网应激所引起的。研究表明内质网应激还与噪声、药物、年龄等因素造成的听力损伤密切相关。

参考文献：

1、Novel de novo ARCN1 intronic variant causes rhizomelic short stature with microretrognathia and developmental delay.[J]. Tidwell Timothy;Deshotel Malia;Palumbos Janice;Miller Chris;BayrakToydemir Pinar;Carey John C.Cold Spring Harbor molecular case studies,2020

2、GRP78: A cell's response to stress[J]. Ibrahim M. Ibrahim;;Doaa H. Abdelmalek;;Abdo A. Elfiky.Life Sciences,2019

3、郑泉,王国庆,赵读洋,等.arcn1b缺乏通过诱导内质网应激影响斑马鱼听觉功能[J].中华耳科学杂志,2023,21(06):854-860.

4、The C/EBP Homologous Protein (CHOP) Transcription Factor Functions in Endoplasmic Reticulum Stress-Induced Apoptosis and Microbial Infection.[J]. Hu Hai;;Tian Mingxing;;Ding Chan;;Yu Shengqing.Frontiers in immunology,2018

5、耳蜗毛细胞再生机制研究最新进展[J]. 韩贺舟;董耀东;魏薇;马秀岚.中华耳科学杂志,2020(05)

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