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METTL3对胶质瘤细胞增殖及侵袭影响的实验研究

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2024-10-15 13:26

研究背景胶质瘤是中枢神经系统的原发性恶性脑肿瘤,其恶性程度远高于其他原发性脑肿瘤,起源于星形胶质细胞的胶质母细胞瘤(glioblastoma,GBM)居首位。目前,胶质瘤的病因和分子机制尚不清楚。除了电离辐射和遗传因素外,没有其他确切的病因。目前,手术、放疗和化疗仍是脑胶质瘤患者的主要治疗方法,但由于肿瘤高度侵犯重要的脑功能区,患者往往会出现并发症,预后不良。尽管替莫唑胺和其他有效的化疗药物在治疗脑胶质瘤方面取得了进展,但患者的中位生存时间并未显著延长。此外,由于胶质瘤细胞恶性增殖和侵袭的特点,肿瘤复发率很高,患者的生活质量往往较低。因此,迫切需要更有效的治疗靶点。目前分子靶向治疗的出现为临床胶质瘤的治疗带来了巨大希望。近年来,N6甲基腺苷(m6A)的甲基化修饰逐渐成为研究热点。通过对m6A的进一步研究,越来越多的证据表明m6A的异常修饰行为与多种肿瘤的发生、发展和预后密切相关。目前,许多与m6A相关的调节因子被认为是肿瘤治疗的新靶点。此外,相关研究也指出,m6A调节因子的失衡表达在肿瘤细胞的增殖和侵袭等生物学行为中也起着重要的调节作用。其调控因子的异常表达可以通过激活和抑制相关信号通路和靶点,影响肿瘤细胞增殖和侵袭的生物学行为,从而导致肿瘤的恶性进展。甲基化转移酶样3(METTL3)是m6A甲基化修饰过程中唯一的催化亚基。近年来,越来越多的证据表明,METTL3与多种肿瘤的发生和发展有紧密联系,METTL3在多种肿瘤中可能发挥促癌或抑癌作用。此外,相关研究和报道也曾指出,METTL3的m6A甲基化转移酶活性还可能对多种肿瘤细胞的增殖及侵袭等生物学行为产生影响,从而导致肿瘤的恶性进展和患者的不良预后,但目前METTL3在胶质瘤中的表达情况和作用尚未得到很好的证实和解释。目的本实验研究的主要目的在于明确METTL3在胶质瘤中的表达及其与临床病理参数的相关性,以及当其表达水平变化时对胶质瘤细胞系增殖及侵袭能力的影响。方法首先通过肿瘤基因组图谱(TCGA)数据库分析METTL3在胶质瘤中的表达情况。第二步选取50例临床胶质瘤患者的肿瘤组织及癌旁组织,并常规培养人正常胶质细胞NHA细胞和胶质瘤细胞系U87、U251细胞。实验通过采用免疫组织化学染色(IHC)、实时荧光定量PCR(qRT-PCR)及免疫蛋白印迹(Western Blot)等相关实验,分别以组织学和细胞学为基础检测METTL3在胶质瘤中的表达情况。第三步将临床胶质瘤患者的相关病理病例资料进行统计学分析,结合临床进一步了解METTL3表达水平与胶质瘤患者病理参数之间的相关性。第四步通过细胞转染的方式在U87、U251细胞中构建METTL3沉默及过表达模型,并同步转染空白对照组。转染后,分别通过qRT-PCR及Western Blot实验检测各组细胞中METTL3 m RNA及蛋白质的表达水平,以确认细胞模型构建成功。再利用细胞平板克隆形成、CCK-8及Transwell等实验,考察不同表达水平的METTL3对胶质瘤细胞系U87、U251细胞增殖及侵袭能力的影响,并对相关结果进行统计学分析。结果TCGA数据库结果显示,与正常脑组织相比,METTL3在低级别胶质瘤(LGG)和高级别胶质瘤(GBM)中表达均增加,提示METTL3可能与胶质瘤的发生发展有一定的关联。IHC、qRT-PCR及Western Blot实验结果表明,相比于癌旁组织样本,METTL3在肿瘤组织样本中呈高表达水平,并且肿瘤组织病理级别越高,METTL3的表达水平越高(P0.01);qRT-PCR及Western Blot实验结果显示,METTL3在U87及U251细胞中表达水平明显高于NHA细胞(P0.01)。统计学方法分析METTL3表达水平与临床胶质瘤患者的病例参数,包括年龄、患者性别差异、肿瘤部位及肿瘤级别的相关性,结果显示,METTL3表达水平与肿瘤组织病理级别呈显著正相关(P0.001),而与其他病理参数无相关性。qRT-PCR及Western Blot实验结果指出,与空白对照组相比较,METTL3沉默组(sh METTL3)各细胞中METTL3 m RNA及蛋白表达水平均降低(P0.01),而METTL3过表达组(oe METTL3)各细胞中METTL3 m RNA及蛋白表达水平均增加(P0.01),这一结果证实了细胞模型的成功构建。细胞平板克隆形成和CCK-8实验结果显示,与对照组细胞的增殖能力相比,METTL3低表达会抑制U87、U251细胞的增殖能力(P0.01);相反,过表达METTL3可以使U87、U251细胞的增殖能力增强(P0.01)。Transwell实验结果指出,在U87、U251细胞中敲低METTL3表达水平后,U87、U251细胞的侵袭能力明显低于对照组细胞(P0.01);而在U87、U251细胞中过表达METTL3后,U87、U251细胞的侵袭能力则明显高于对照组细胞(P0.01)。结论1.METTL3在胶质瘤组织及细胞系中表达水平均增加,并且其表达水平与临床患者肿瘤组织病理级别呈显著正相关。2.过表达METTL3可以促进胶质瘤细胞株U87、U251的增殖和侵袭能力,而下调METTL3表达水平后则会抑制U87、U251细胞的增殖和侵袭。3.METTL3与胶质瘤的发生发展密切相关,其在胶质瘤中可能是促癌基因。