达格列净通过抑制外侧缰核改善糖尿病大鼠抑郁样行为的机制研究
研究目的:糖尿病(diabetes mellitus,DM)在全球范围内的发病率居高不下,其所造成的危害极大。DM患者抑郁症的发病率是普通人群的2-3倍,严重影响DM患者的生活质量,甚至是导致患者死亡的重要原因之一,但由于其发病机制不明,限制了临床有效治疗。达格列净是一种新型的口服降糖药,属于钠葡萄糖共转运体2(sodium glucose cotransporter 2,SGLT2)抑制剂。值得关注的是:达格列净可以改善DM患者的抑郁症状,但机制不明,涉及的中枢部位更是所知甚少。有研究表明,DM动物模型脑组织中五羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)含量明显减少,而5-HT神经递质的减少在抑郁症发病中发挥重要作用。中缝背核(dorsal raphe nucleus,DRN)是脑内合成和释放5-HT的关键部位,但一些抗抑郁药的作用靶点并不在DRN,提示其上游结构可能在DM患者抑郁症发病中发挥更为重要的作用。外侧缰核(lateral habenula,LHb)是控制DRN的关键脑区,其在抑郁症发病中的重要作用在动物实验和临床治疗中均得到了证实,且LHb分布有SGLT2,因此我们推测达格列净可能通过影响LHb神经元活动,改变DRN中5-HT水平,进而改善DM大鼠抑郁样行为。本研究旨在探讨LHb在DM大鼠抑郁样行为中的作用及达格列净通过LHb改善DM大鼠抑郁样行为的作用机制,为临床DM患者抑郁症的防治提供新的靶点、提出新线索。研究方法:本研究主要采用了脑立体定位技术、套管植入和微量注射技术、化学遗传技术、高效液相色谱分析、分子生物学技术、生信分析、膜片钳电生理记录等研究方法。(1)DM抑郁模型的建立及行为学检测通过6周的高脂饮食(high fat diet,HFD)联合小剂量链脲霉素(streptozotocin,STZ,35 mg/kg)建立DM模型,通过强迫游泳试验(forced swim test,FST)筛选出DM抑郁(diabetes mellitus depressed,DMD)模型,并通过FST、旷场试验(open field test,OFT)和糖水偏爱试验(sucrose preference test,SPT)对大鼠行为进行检测,验证DMD模型是否成功。(2)达格列净灌胃给药DMD大鼠给予达格列净灌胃(1 mg/kg/d)治疗6周,观察达格列净整体给药对DMD大鼠血糖、抑郁样行为、LHb中c-Fos表达、LHb中SGLT2及AMPK-GABABR信号通路相关蛋白表达的影响。(3)LHb微量注射达格列净通过脑立体定位技术在DMD大鼠LHb植入套管,并在LHb微量注射达格列净(500 ng/ml,0.2μl/side),注射30 min后观察DMD大鼠血糖、抑郁样行为、LHb中c-Fos表达、DRN中5-HT活性、LHb中SGLT2及AMPK-GABABR信号通路相关蛋白表达的影响。(4)化学遗传学方法操控LHb神经元活动在DMD大鼠LHb注射抑制性病毒r AAV2/9–Ca MKIIa–h M4D(Gi)–m Cherry–WPREs,3周后h M4D在LHb稳定表达。腹腔注射CNO(2 g/kg)抑制LHb谷氨酸神经元,45 min后观察DMD大鼠血糖、抑郁样行为的改变。(5)高效液相色谱法检测DRN内5-HT和其代谢产物水平在LHb微量注射达格列净后对DMD大鼠DRN中5-HT和其代谢产物5-羟基吲哚乙酸(5-hydroxy-indoleacetic acid,5-HIAA)进行检测,通过计算5-HIAA/5-HT比值评估DRN中5-HT活性的变化。(6)生信分析筛选相关信号通路筛选DM合并抑郁症的核心风险基因,并对DM合并抑郁症的核心风险基因进行KEGG通路富集分析筛选出可能影响DM大鼠抑郁样行为的信号通路。(7)分子生物学技术检测相关蛋白表达免疫组织化学染色检测大鼠LHb中c-Fos的表达变化;Western blot检测大鼠LHb中c-Fos、SGLT2、p-AMPK、AMPK、GABABR2和p-GABABR2(S783)的表达变化。(8)膜片钳电生理记录方法记录神经元放电比较Control组和DMD组大鼠LHb神经元动作电位放电频率的差异,并观察20μM浓度的达格列净灌流对DMD大鼠LHb神经元动作电位放电频率的影响。研究结果:(1)成功建立DMD模型与正常大鼠相比,DMD大鼠血糖明显升高,并表现出抑郁样行为:OFT中心区域持续时间明显减少,FST不动时间明显增加,SPT糖水偏爱指数显著减少。(2)达格列净灌胃对DMD大鼠血糖和抑郁样行为的影响与对照组相比,达格列净灌胃治疗可明显改善DMD大鼠的血糖和抑郁样行为:OFT中心区域持续时间增加,FST不动时间减少,SPT糖水偏爱指数增加。(3)LHb在DMD大鼠抑郁样行为中的作用免疫组织化学染色和Western blot结果显示:与对照组相比,DMD大鼠LHb中c-Fos表达明显增加,达格列净灌胃治疗可显著降低DMD大鼠LHb中c-Fos表达;特异性抑制LHb谷氨酸神经元可明显改善DMD大鼠的血糖和抑郁样行为:OFT中心区域持续时间增加,FST不动时间减少,SPT糖水偏爱指数增加;(4)达格列净通过抑制大鼠LHb神经元活动改善DMD大鼠的抑郁样行为与对照组相比,LHb局部微量注射达格列净可显著改善DMD大鼠的抑郁样行为:OFT中心区域持续时间增加,FST不动时间减少,SPT糖水偏爱指数增加;LHb局部微量注射达格列净可显著减少DMD大鼠LHb中c-Fos表达,并使受LHb调控的下游核团DRN中5-HIAA/5-HT明显增加,即5-HT活性增加,但对血糖无改善;膜片钳电生理结果显示:与正常大鼠相比,DMD大鼠LHb神经元放电频率明显增加,达格列净灌流可以抑制DMD大鼠LHb神经元放电频率。(5)生信分析探索及验证达格列净抑制LHb神经元活动的分子机制通过生信分析共获得DM合并抑郁症的风险基因576个,通过构建DM合并抑郁症风险基因的PPI网络,并通过两次筛选发现GABABR是DM合并抑郁症的核心风险基因之一;对DM合并抑郁症风险基因的KEGG通路富集分析共得到194条通路,AMPK信号传导通路是参与调控DM合并抑郁症的主要通路,提示AMPK-GABABR可能参与调控LHb神经元活动;对生信分析结果进行验证:与正常大鼠相比,DMD大鼠LHb中SGLT2表达上调,p-AMPK和p-GABABR2(S783)表达下调,AMPK-GABABR信号通路被抑制,差异具有统计学意义。达格列净灌胃治疗或在LHb局部微量注射达格列净均可使DMD大鼠LHb中SGLT2下调,p-AMPK和p-GABABR2(S783)表达上调,即AMPK-GABABR信号通路被激活,差异具有统计学意义。研究结论:DM大鼠的抑郁样行为与LHb神经元活动增加有关,抑制LHb神经元活动可改善DM大鼠的抑郁样行为;LHb是达格列净的作用靶点,介导了达格列净在DM大鼠的抗抑郁作用;达格列净通过激活LHb的AMPK-GABABR信号通路抑制LHb神经元活动,进而提高DRN的5-HT活性,实现其抗抑郁作用。
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