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【小动物活体成像】小动物活体成像技术在肿瘤研究中的应用

萌宠菠菠乐园
2024-10-16 05:12

摘要:

活体成像技术可以在近无创条件下对活体组织或小动物体内的生物学行为进行成像跟踪,已被广泛应用于肿瘤研究中. 它的优势在于非侵入性地连续动态检测活体内肿瘤的生长及转移和评价肿瘤治疗的疗效. 与传统的检测方法相比, 大大减少了动物的用量, 符合“3R”原则. 文中综述了小动物活体成像技术的成像模式、技术原理和路线及其在肿瘤生长、转移与治疗过程中的应用.

关键词:

活体成像; 生物发光; 荧光; 放射性同位素; X 光; 肿瘤

活体成像一般是指生物体处于活体状态下,在细胞和分子水平上应用多种成像模式对各种生物行为进行定性和定量分析研究的一种新技术.与传统的体外成像或切片相比, 活体成像有着诸多优点: (1)可以在同一个体反复多次获得一系列数据, 消除个体差异, 不需要杀死动物, 节省人力物力; (2)可以动态观察实验结果, 并得到直观的图像, 结果一目了然; (3)能够非侵入式地检测活体内特异的生物学行为, 最大限度地模拟人体内的生理病理状态. 基于活体成像的诸多优点, 该技术的应用也十分广泛, 更是肿瘤学研究领域中有力的研究工具.

1 动物活体成像模式及原理

目前小动物活体成像模式主要包括生物发光成像(Bioluminescence)、荧光成像(Fluorescence)、同位素成像(Isotopes)、X 光成像(X-ray)等, 它们各自的优缺点和适用范围都有所不同(表1).

1.1 生物发光成像

生物发光所需的激发能量来自生物体内由荧光素酶催化的反应, 这种酶与相应底物荧光素发生生化反应并产生光信号, 在体外通过成像系统可直观检测到光信号的产生及变化, 从而对小动物体内肿瘤的生长及转移、免疫反应、特定基因的表达等诸多生物过程进行实时直观的监测. 成像信号强弱取决于荧光素酶的表达水平、酶底物(荧光素)存在状况以及ATP、氧气含量和组织深度[1].与传统影像学成像技术相比, 生物发光成像的背景噪音低, 图像较清晰, 灵敏度高, 可以准确地定位发光位点; 一旦购买或建立动物模型, 成像实验较为简单; 尤其适合于肿瘤细胞和其它类细胞的研究. 但是, 荧光素酶-荧光素反应会使荧光素酶高表达的肿瘤生长受到抑制, 其原因可能与反应后ATP 水平下降、副产物的形成以及缺氧有关[2].

1.2 荧光成像

荧光发光成像技术是采用特定的荧光蛋白(绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白等)或外源性荧光基团(如菁色素、量子点、镧系元素)进行标记[3], 在特定波长的光源照射下释放出光子, 从而产生发光.区别于生物发光成像技术的是, 荧光标记基团本身就是一个生物发光系统, 其激发荧光是一个特异性的独立过程, 无需协同因子、底物和其它基因产物的介导. 但由于生物体内很多物质都会产生发光, 如皮肤、毛发、鼠粮等, 这就使得特定波长下荧光成像会出现一定的背景噪音, 使信噪比低于生物发光成像. 但随着当前活体成像技术的不断发展, 可通过使用背景扣除、近红外波长染料、多光谱分析技术等方法去除或减弱这种背景噪音.

1.3 放射性同位素成像

同位素成像是利用放射性同位素作为示踪剂,对研究对象进行标记, 并进行活体成像的一种微量分析方法, 属功能显像. 它包括正电子发射断层成像技术(Positron Emission Tomography, PET)和单光子发射断层成像技术(Single Photon EmissionComputed Tomography, SPECT)两种形式. PET 的灵敏度非常高(10-11~10-12 mol·L-1), 由于其使用的正电子同位素具有相当短的半衰期, 所以同位素整合母体分子的化学反应以及后续母体分子导入活体的操作必须迅速进行, 适合快速动态研究. 在SPECT 成像中, 标记化合物的放射性同位素能发出一种或多种具有特征能量的γ射线. 与PET 成像不同的是, 两种或两种以上被标记不同放射性同位素的化合物可在同一项研究中被区分, 所以SPECT 可以允许同时对多种事件进行分开检测[4-5].然而, PET 比SPECT 提供更多的定量数据, 特别是PET具有更高的敏感性, 有可能被用于评估低水平的细胞活动[6]. 目前, PET 和SPECT 在分子水平上提供了生理信息, 非常适合监测许多重要的过程,如葡萄糖代谢, 血流量和灌注, 受体-配体结合率以及氧气的利用率.

1.4 X 光成像

X 光是一种高能量且穿透性很强的射线. 它对不同物质的穿透性由射线强度、频率、阻挡物质与射线作用程度、阻挡物质比重及大小等因素共同决定. X 光成像在骨研究中有着广泛的应用, 由于骨骼含钙量高、比重高, 其吸收的X 射线量最多, 成像时可与周围的组织和器官形成鲜明对比, 能直接进行成像. 对于其它大部分组织和器官, X 光的穿透率大体相同, 与周围环境没有明显的对比度,不能直接进行X 光成像. 但可以通过造影剂靶向特定的器官和组织增加其对比度, 从而形成活体成像, 并最终确定特定器官的位置. 因此, X 光成像可以清晰地展示实验动物的内部的解剖学成像.其主要的缺点是研究对象需持续暴露于电离辐射下, 尤其在重复研究时, 电离辐射可能会影响肿瘤的特性, 从而影响实验结果[7].

2 小动物活体成像在肿瘤研究中的几个关键技术

2.1 动物模型制备

建立肿瘤模型首先必须解决宿主动物的免疫排斥反应, 因此免疫缺陷动物是异种移植的最佳受体[8]. 根据实验研究内容不同, 肿瘤的接种途径亦有所不同, 常见的有尾静脉注射、皮下移植和原位移植等方法. 除此之外, 在建模时, 要根据实验目的来选择合适的标记方式. 如在荧光成像中, 激发光波长短, 穿透性弱, 一般只能达深度1~2mm,适合皮下瘤和解剖后脏器肿瘤的直接成像; 而深部脏器肿瘤的成像宜选择生物学发光成像.

2.2 活体成像

影响成像效果的因素较多, 主要包括以下几个方面: (1)成像软件: 利用高灵敏度的电荷耦合元件(Charge-Coupled device, CCD)探测器, 使用离散的窄带带通滤波器或电调滤波器, 改善多光谱分析软件算法以及提高位于动物两侧的激发光源和探测器之间的透射能力, 可使生物发光或荧光成像的灵敏度和分辨率增加[9]; (2)荧光发光标记: 荧光发光成像宜选择发射波长较长的探针. 近些年报道的一种称为Katushka 的新型荧光蛋白, 它拥有超过620 nm 的发射波长, 且能对深部组织进行成像, 是目前成像效果最好的蛋白[10]; (3)自发荧光干扰: 动物的毛发、体内食物等产生的自发荧光会降低荧光的信噪比, 减弱成像的灵敏度, 从而影响了成像效果. 因此, 可以采用无荧光素鼠粮饲养小鼠、剃去小鼠毛发等方法减少自发荧光, 也可以利用成像系统通过软件处理除去荧光信号.

3 小动物活体成像技术在肿瘤研究中的应用在肿瘤研究中, 可采用活体成像技术无创地定量检测小动物整体的原位瘤、转移瘤及自发瘤的大小及转移情况, 以及对癌症治疗过程中癌细胞的变化进行实时、原位、活体的观测和评价.

3.1 肿瘤细胞成像

采用发光基团标记肿瘤细胞, 使之成为发光源, 然后接种活体就可实现肿瘤细胞活体成像. 在一定范围内, 随细胞增多发光信号逐渐增强. 利用荧光素酶标记的胃癌细胞, 通过观察ApoG2 蛋白体外抑制胃癌细胞生长的效果, 发现随该蛋白量增加, 检测到胃癌细胞荧光素酶活性逐渐降低[11].

通过探针标记乳腺癌细胞后, 甚至可以在单细胞水平动态观察药代动力学变化[12]. 通过观察在细胞内用荧光素酶标记p16 蛋白从而建立细胞模型,可以适时检测肿瘤生成和细胞衰老情况[13]. 因此,活体成像技术是肿瘤形成研究强有力的工具.

3.2 肿瘤转移过程成像

小动物活体成像系统能通过对发光信号的检测而追踪肿瘤的转移过程, 包括观察癌细胞在血管中的停留、外渗和转移灶等一系列过程, 甚至能够检测到少于100 个细胞的肿瘤微小转移病灶, 从而对发现肿瘤早期诊断与治疗提供帮助. 生物发光成像可以确定两种转移性嗜铬细胞瘤的特征情况[14]. 利用近红外荧光探针标记, 可以简单、快速、无放射性地活体观察胶质母细胞瘤的转移情况[15].

利用生物发光成像技术观测不同亚群癌细胞向肺部的转移情况和转移活性, 再检测基因在细胞内的表达差异确认了一系列与乳腺癌肺转移有关的基因[16], 给肿瘤转移机制的研究提供了巨大帮助.

3.3 肿瘤治疗过程的成像

在肿瘤药物研究中, 利用荧光染料或放射性同位素标记药物, 可直接在活体水平观察到药物对肿瘤的是否靶向肿瘤、最佳靶向时间及药物在动物其它器官组织的积累, 有利于研究人员在最佳的时间, 进行组织分析及其它下游分子水平研究.同时也帮助研究人员选择需要分析的器官组织,以便进行药物作用机制等研究. 整体成像不仅在手术过程中对肿瘤进行精确定位, 还可评价肿瘤手术切除后的发展状况. 在免疫治疗的研究中, 利用膜锚定Gaussia 荧光素酶的高强度信号对T 淋巴细胞进行生物发光成像, 通过遗传修饰的肿瘤特异性嵌合抗原受体介导证明T 淋巴细胞在肿瘤中聚集、停留以及与肿瘤细胞的相互作用[17]. 在基因治疗中, 光学成像技术可挖掘病毒特异性靶向肿瘤细胞的基因治疗潜能[18]; 也可探究微小RNA(microRNA, miRNA)对肿瘤增殖及转移的影响[19];还可以观察采用特定运送方法进入肿瘤细胞中的小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)的传递及沉默过程, 提高了基因治疗的目的性[20].

4 展望

由于各种成像技术的原理、方法、优缺点等都各不同, 因此其研究对象和应用领域也各不相同.在活体成像研究中, 一定要结合具体的研究方向和实验目的选择合适的成像模式. 同时, 也可以将两种或多种模式相结合, 优势互补, 使得实验结果更可靠更有说服力. 例如, 肿瘤研究用生物发光标肿瘤细胞, 用荧光或同位素标记肿瘤药物, 用X 光成像作为解剖学背景, 三者相叠加, 既能准确定位肿瘤细胞在体内的位置, 又能看到肿瘤治疗的药物在体内的分布, 是否靶向到肿瘤, 直观明了. 这种多模式组合的活体成像技术将使得活体成像研究提升到全新的水平, 为研究工作提供更充分详实的数据, 满足当今多种领域里研究的需要.

⭐️ ⭐️ ⭐️

目前常见的分子影像技术如X-射线成像、断层扫描成像（CT）、磁共振成像（MRI）和超声成像（US）被用于对疾病等的医疗诊断，但这些方法具有较差的空间分辨率及其无法实现动态实时监测等缺点。

传统荧光成像技术存在一个显著的缺点是探测深度相对较低，光子穿透能力受光子在生物组织的吸收以及散射影响，荧光成像的噪音与背景一般来源于生物组织的自体荧光以及光子散射。由于光折射率在微观尺度上存在的不均一性，生物组织体对光具有强散射性，然而这些散射一般随着光的波长增长呈指数性衰减。

近红外二区成像（1000-1700nm）与可见光成像（400-780nm）和近红外一区（780−1000nm）相比，因其在样品中的散射与吸收系数更小，因此具有更高的成像分辨率与穿透深度。近红外二区成像系统针对小动物成像分辨率一般可达30um，能对细小的血管直接成像；穿透深度大致为3cm，即便是小鼠最深的脏器发出的信号也能被检测到。

近红外二区光学成像技术以其高灵敏度、高时空分辨率、信噪比高、成像深度大、自发荧光低、生物损伤小等优点，为微小肿瘤/转移瘤及肿瘤相关血管的检测和研究提供了一种新的无创检测成像手段，在活体成像、疾病诊断、无创治疗、手术导航等领域应用前景广泛。

小动物活体成像

相机部分：

1、成像模块采用TEC电制冷方式，工作温度达到-100℃；

2、对于微弱信号可实现不短于99秒的连续曝光；

3、近红区与可见光区实时同步成像，图像同步精确融合；

4、近红区与可见光区实时同步录像，视频同步精确融合；

激光部分：

1、激发光源采用两种波长（808nm, 980 nm），功率可调；

2、两根液芯匀光光纤分布两侧无死角照射；

3、光纤末端配备准直器，可调激发光的均匀照射；

暗室及控制系统：

1、去除背景，实现成像的平场校正功能；

2、调节红外成像窗宽、窗位功能；

3、荧光寿命成像专用软件模块‘；

4、实现材料长时间的荧光寿命成像；

5、寿命图像与材料单光子寿命分析结果误差极小；

6、多通道气体麻醉，大视野满足多个小动物同时成像；

应用：

适合从事生物学、医学、材料等科研工作者，例如生物医学荧光成像、材料学荧光成像、荧光偏振成像、荧光寿命成像、激光光斑分析等领域。

⭐️ ⭐️ ⭐️ 应用案例⭐️⭐️ ⭐️

【案例1】NIR-I区与NIR-II区，成像范围、深度、清晰度对比：

【案例2】近红外二区成像在不通波长下成像比较

通过尾静脉注射PBS溶液中的NM-NPs雌性BALB/c小鼠。用1000LP、1250LP、1400LP滤光片进行160mW cm−2808 nm激光激发，当波长在1000~1400 nm之间变化时，血管的清晰度明显提高，1400LP滤光片NIR-II荧光成像的空间分辨率明显提高，清晰度显著提高。

【案例3】近红外二区成像用于药代释放测试

特定器官和组织中的药物浓度通常用破坏性方法测量，费时费力。针对小剂量毒性药物，可使用功能化的红外探针，与药物接触时发光峰会发生削弱与红移，以实现对药物的检测。将纳米探针放入可长时间存留于生物体内的条形生物膜中，并植入皮下、腹腔内等不同腔室，药物在腹膜内释放后，可检测到内侧纳米探针发光强度减弱与红移。

【案例4】近红外二区成像用于药代动力学监测

临床前药代动力学(PKs)的常用方法为在不同的时间点抽取血液，并通过不同的分析方法对血液水平进行定量。NIR-II可以通过测量麻醉小鼠眼睛和其他身体区域中标记化合物的荧光强度，无创地连续监测血液水平。通过非侵入性眼睛成像测量的血液水平与通过经典方法产生的结果之间有极好的相关性。全身成像显示预期区域(如肝脏、骨骼)有化合物积聚。所以眼睛和全身荧光成像的结合能够同时测量血液PKs和荧光标记化合物的生物分布。

【案例5】近红外二区成像在缺血性脑卒中应用

稀土纳米颗粒（RENPs）是一类稀土离子掺杂的荧光纳米材料，能够在近红外光激发下发射出位于第二近红外区的荧光。且其具有长荧光寿命、窄发射谱带、高光/化学稳定性、低毒性和可调谐荧光发射波长等优势，有望在生物分析和疾病诊断等领域发挥重要作用。利用染料敏化RENPs的复合材料，成功实现了非侵入性、高分辨率脑血管成像，清晰观察到脑血管网络结构及细小的毛细血管结构，并可实时监测生理过程中血液动力学及血管结构的变化。

缺血性脑卒中（Ischemic Stroke, IS）是导致长期残疾以及死亡的主要原因之一，该疾病的严重程度具有时间依赖性，及时评估IS对于该疾病的治疗以及预后起着至关重要的作用。利用比率型近红外二区纳米探针可有效富集在脑缺血病灶位点，可视化氧化应激水平用于及时评估IS。利用近红外二区成像的优势，该探针具有深层的脑组织穿透深度；基于目标物调控染料敏化RENPs发光的原理，该探针对高活性氧物种呈现优异的响应性能。综合以上功能，该探针通过可视化探针在病灶位点的富集程度以及氧化应激水平，在IS发生30min时即可对其进行监测，并评估其严重程度（传统磁共振成像则在IS发生24h才可观察到显著的信号变化）。

【案例6】近红外二区成像用于心肌梗死监测

利用近红外荧光成像的优越采集速度和近红外发射纳米粒子的有效选择性靶向，在急性梗塞事件后仅几分钟就获得了梗塞心脏的体内图像。

【案例7】近红外二区成像用于慢性肝脏疾病无创监测

准非酒精性脂肪性肝病（NAFLD），由于缺乏用于监测炎症和肝纤维化进程的无创方法，肝活检仍是临床诊断NAFLD的金标。非酒精性脂肪性肝病的病理发展中氧化应激是关键驱动力之一，肝损伤和坏死性炎症由驱动纤维化的活性氧簇（ROS, Reactive oxidative species）介导，内源性脂褐素（lipofusion）是ROS的副产物，在808nm激光激发下，能够在近红外范围内被检测到，因此脂褐素的红外成像用于无创评估坏死性炎症活动和纤维化阶段，实现慢性肝病的无创监测。

【案例8】近红外二区成像用于阿尔兹海默症监测

近红外荧光(NIRF)成像已广泛用于临床前研究；然而，它的低组织穿透性对于神经退行性疾病的转化临床成像来说是一个令人生畏的问题。众所周知，视网膜是中枢神经系统(CNS)的延伸，被广泛认为是大脑的窗口。因此，视网膜可以被认为是研究神经退行性疾病的替代器官，并且眼睛由于其高透明性而代表理想的NIRF成像器官。利用CRANAD-X荧光探针标记淀粉样蛋白β(aβ)，并利用成像系统对眼部进行观察可以明显观察到患病前后及治疗前后眼部的荧光强度的差异，进而在未来的人类研究中具有显著的转化潜力，并可能成为未来快速、廉价、可获得和可靠筛查AD的潜在成像技术。

【案例9】近红外二区成像用于体内脂质积累情况监测

细胞中脂质异常积累，通常预示着动脉硬化、脂肪肝等疾病。采用单壁碳纳米管荧光探针，通过近红外发射无创测量细胞中的脂质积累。在注射24 h后，探针富集在肝脏部位，与脂质结合后会使发光峰蓝移，积累越多则蓝移现象越明显，由此实现对脂质的定量检测。该方法可广泛应用于简化药物开发过程，并推动脂质相关疾病的研究。

【案例10】近红外二区成像联合酶激活的纳米探针用于术中进行快速组织病理学分析

准确的分析病理组织是肿瘤手术成功的关键之一，一种可被基质金属蛋白酶(MMP)14激活的NIR-II纳米探针A&MMP@Ag2S-AF7P，可用于体内外神经母细胞瘤诊断和非破坏性的组织病理学分析。

（1）A&MMP@Ag2S-AF7P在正常组织中的荧光可以忽略不计；但是在神经母细胞瘤组织中，其荧光信号会由于过表达的MMP14抑制了Ag2S量子点和A1094之间的荧光共振能量转移(FRET)过程而被快速激活。

（2）与此同时,暴露的膜渗透多肽R9 (TAT-peptide)可以使得该纳米探针被癌细胞有效地内化，进而产生优越的T/N组织信号比值。该探针可以对病灶进行富集定位通过红外二区实时成像描绘出明确的肿瘤边缘，用于癌症手术或组织活检。

【案例11】近红外二区成像指导肿瘤摘除手术

NIR-II成像的高灵敏度可对肿瘤组织进行精准定位。利用靶向NIR-II荧光探针成像并引导进行小鼠头部肿瘤切除手术。实验分两组进行，在完全切除手术后(左二)，选区线扫结果显示病灶部位近红外信号明显减弱，与健康组织相似，在对比实验(右二，人为留下少部分肿瘤组织)中则观察到部分区域仍存在高强度信号，肿瘤组织的切除并不完全，表明NIR-II在肿瘤摘除手术中具有潜在的指导作用。

【案例12】近红外二区NIR-II协同肿瘤光热治疗

纳米粒子(NPs)辅助光热疗法(PTT)是一种有前途的癌症治疗方式，并且已经吸引了科学主流的注意。利用聚集诱导发射(AIE)纳米颗粒和肿瘤细胞来源的“外泌体帽”(TT3-oCB NP@EXOs)制备具有增强的第二近红外(NIR-II，900–1700nm)荧光特性和PTT功能。由于它们在808 nm照射下具有高且稳定的光热转换能力，因此TT3-oCB NP@EXOs可以用作仿生的NPs用于NIR-II荧光成像引导的肿瘤PTT，因此，随着其他靶向性差的AIE纳米粒子的验证，肿瘤细胞衍生的EXO/AIE纳米粒子杂化纳米囊泡可能为改善肿瘤诊断和PTT提供一种替代的人工靶向策略。

【案例13】近红外二区成像测试荧光寿命

⭐️ ⭐️ ⭐️ 案例结束⭐️⭐️ ⭐️

沈阳莫德医药自主研发近红外二区小动物活体荧光成像系统，性能优异深受用户好评，欢迎您的咨询！

小动物活体成像

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