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超高效液相色谱

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2024-11-14 18:52

摘要：建立了一种简单、快速的测定宠物配合饲料中6种霉菌毒素超高效液相色谱-串联质谱检测方法。样品经提取液提取，MLJ-1固相萃取柱净化，采用多反应监测模式对霉菌毒素进行测定。结果表明，该方法能快速完成样品前处理及6种目标化合物的测定，6种霉菌毒素在3个浓度添加水平的回收率为75.2%～105.6%，相对标准偏差为2.6%～7.6%。该方法操作简单、快速，适合宠物配合饲料中6种霉菌毒素的测定。

霉菌毒素作为某些霉菌在生长或生殖过程中产生的次级有毒代谢产物[1]，是广泛污染谷物、干果、蔬菜、水果及其加工物的一类天然污染物[2]。宠物饲料配方中含有谷物，如玉米、水稻等，如果谷物类产生霉菌毒素，能导致动物生产性能下降、繁殖力降低、免疫力低下、呕吐、腹泻、器官坏死等慢性和急性中毒症状[3]。已经确认化学结构的霉菌毒素达400多种，其中，对动物生产影响较大的主要有黄曲霉毒素B1、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、T-2毒素和玉米赤霉烯酮等，宠物饲料中霉菌毒素污染问题已经受到普遍关注。

霉菌毒素检测方法主要分为快速筛查和确证检测方法。快速筛查方法包括酶联免疫[4]试剂盒、胶体金试纸条等，具有简单、快速、成本低等特点，但存在一定的假阳性和假阴性，难以准确定量。确证检测方法主要有高效液相色谱法、液相色谱-串联质谱法等，其中液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）方法由于具有定性和定量准确、灵敏度高、多组分同步检测等优点，已经成为饲料中霉菌毒素确证检测的主流方法。宠物饲料样品基质复杂，LC-MS/MS检测前需要进行样品前处理，特别是净化处理。常用的样品前处理方法包括免疫亲和柱法[5,6]、免疫磁珠法[7]、Qu ECh ERS[8]等，虽然这些方法能够有效去除样品中杂质的干扰，但是存在操作复杂、费时耗力等缺点。以多功能柱为代表的通过杂质吸附原理进行净化的技术逐渐兴起，该方法净化时不需要柱活化、淋洗和洗脱等步骤，具有操作简单、快速、检测通量高等显著优点，已经成功应用于饲料[9]样品中多种霉菌毒素的检测。

本研究采用杂质吸附型固相萃取柱MLJ-1[10]，建立宠物配合饲料中6种霉菌毒素超高效液相色谱-串联质谱检测方法，为宠物饲料中多种霉菌毒素同步测定提供一种简单快速、准确可靠的方法。

1、材料与方法

1.1 材料

猫粮、犬粮、猫罐头为市售产品。

1.2 仪器与耗材

LCMS 8050型超高效液相色谱-串联质谱（日本岛津公司）；涡旋仪（德国IKA公司）；高速冷冻离心机（日立公司）；纯水仪（Rephile公司）；MLJ-1型固相萃取柱（北京六角体科技有限公司）；0.22μm尼龙滤膜（美国Agilent公司）。

1.3 标准品与试剂

6种霉菌毒素标准品：黄曲霉毒素B1(AFB1）、赭曲霉毒素A、T-2毒素、玉米赤霉烯酮、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、伏马毒素B1+B2(FERMENTEK公司）。

乙腈、甲醇（色谱纯，美国TEDIA公司）、乙酸铵（色谱纯，美国J.T.Baker公司）、甲酸（色谱纯，美国ROE公司）。

1.4 溶液配制

6种霉菌毒素混合标准储备液配制：分别准确称取适量黄曲霉毒素B1、T-2毒素、赭曲霉毒素A、玉米赤酶烯酮、伏马毒素B1+B2、脱氧雪腐镰刀菌烯醇6种霉菌毒素标准品，配成浓度均为100μg/m L的标准储备溶液。

100 mmol/L乙酸铵溶液：准确称取0.770 8 g乙酸铵加水定容至100 m L，摇匀。

流动相：A相为0.1 mmol/L乙酸铵/0.1%甲酸-水，准确量取甲酸1 m L和100 mmol/L乙酸铵溶液1 m L加水定容至1 000 m L，摇匀。B相为0.1%甲酸-甲醇，准确量取甲酸1 m L加甲醇定容至1 000 m L，摇匀。

1.5 方法

1.5.1 液相色谱条件

色谱柱为Agilent Eclipse Plus C18(3.0 mm×150.0 mm 1.8μm）；流动性：A相为0.1 mmol/L乙酸铵/0.1%甲酸-水，B相为0.1%甲酸-甲醇；流速为0.3 m L/min；柱温为40℃；洗脱方式为梯度洗脱，初始浓度为B相30%。

1.5.2 质谱条件

离子源为ESI；雾化气为氮气3.0 L/min;DL管温度为250℃；干燥气为氮气10 L/min；加热模块温度为400℃；加热气为空气10 L/min；接口温度为300℃；碰撞气为氩气（270 k Pa）；扫描模式为MRM。

1.5.3 标准曲线的绘制

分别准确量取6种霉菌毒素标准储备液，配制成含黄曲霉毒素B1(0.5、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 ng/m L),T-2毒素、赭曲霉毒素A、玉米赤酶烯酮（5、20、50、100、200、500 ng/m L），伏马毒素B1+B2、脱氧雪腐镰刀菌烯醇（10、40、100、200、400、1 000 ng/m L）的系列混合标准工作液，标准图谱见图1，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。线性方程见表1。

1.5.4 样品的提取与净化

1）试样制备。

选取猫粮、犬粮2种样品，用粉碎机粉碎并过孔径0.45 mm的分样筛，充分混匀，放入分装容器中，另取一种猫罐头用匀浆机将其制成匀浆，立即检测上述样品。

2）提取。

称取5 g（精确至0.01 g）试样于50 m L离心管中，加入乙腈-水-甲酸（84.0∶15.9∶0.1，体积比）提取液20 m L，涡旋混匀，振荡提取20 min,8 000 r/min离心10 min，立即移出上清液，备用。

3）净化。

准确移取1 m L上清液取至MLJ-1固相萃取柱，过柱速度约1滴/s，收集全部滤液于进样瓶中，待测。

图1 6种霉菌毒素混合标准溶液图谱

表1 6种霉菌毒素线性方程

2、结果与分析

2.1 净化小柱的选择

宠物饲料成分复杂，其中脂类和色素对检测产生很大干扰，本研究选取了Myco Sep 226净化柱[11]与MLJ-1杂质吸附型固相萃取柱进行了对比，结果发现使用Myco Sep 226净化柱后，添加样品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇等的回收率不理想，而MLJ-1固相萃取柱能更有效地吸附样品提取液中色素等杂质，样品中6种霉菌毒素回收率均能达到要求。

2.2 色谱柱的选择

在使用常规色谱柱Water XBridge C18进样后，发现有部分霉菌毒素未能出峰，后改用超高压快速高分离度的色谱柱Agilent Eclipse Plus C18(3.0 mm×150 mm 1.8μm）后，6种毒素均能良好地被分离。

2.3 检测限和定量限

在空白猫粮、犬粮、猫罐头中添加适量标准溶液，使样品中黄曲霉毒素B1、T-2毒素、赭曲霉毒素A、玉米赤酶烯酮、伏马毒素B1+B2、脱氧雪腐镰刀菌浓度分别为2、20、20、20、40、40μg/kg，根据此加标样品各霉菌毒素目标物的色谱峰，以3倍信噪比（S/N）确定化合物的检出限，10倍信噪比确定化合物的定量限，检出限和定量限如表2所示。

2.4 回收率和精密度

选用猫粮、犬粮和猫罐头3种样品，进行添加回收和精密度试验。样品中添加3种浓度的混合标准溶液，每个添加浓度设6个平行，按本试验方法处理，经LC-MS/MS测定，计算回收率时扣除样品中霉菌毒素的本底值。平均回收率为75.2%～105.6%，相对标准偏差（RSD）为2.6%～7.6%，结果见表3，表明该方法具有良好的准确度和精密度。

表2 检出限和定量限

表3 3种样品中6种霉菌毒素的回收率和相对标准偏差（n=6)

3、小结

本研究基于超高效液相色谱-串联质谱，使用MLJ-1杂质吸附型固相萃取柱净化，建立了宠物配合饲料中6种主要霉菌毒素的检测方法。该方法具有操作简单、快速、准确等优点，为宠物配合饲料样品中霉菌毒素快速检测提供了一种可靠的技术手段。

参考文献:

[4]GB/T 17480-2008,饲料中黄曲霉毒素B1的测定(酶联免疫吸附法)[S].

[5]李洪波,宋志超,陈蔷,等.复合免疫亲和柱净化-UPLC-MS/MS测定饲料中黄曲霉毒素B1､玉米赤霉烯酮和T-2毒素[J].中国饲料,2022(5):79-83.

[6]孙雪,郗存显,唐柏彬,等.复合免疫亲和柱净化-液相色谱-串联质谱法测定动物源食品中6种黄曲霉毒素和6种玉米赤霉醇类真菌毒素残留量[J].分析化学,2016,44(6):970-978.

[7]雷方,李承龙,张新,等.免疫磁珠亲和纯化-超高效液相色谱串联质谱法快速检测小麦中多种真菌毒素[J].食品安全质量检测学报,2016,7(3):1252-1260.

[8]王少敏,黄晓静,毛丹,等.Qu ECh ERS-超高效液相色谱串联质谱法同时测定中药瓜蒌皮中22种真菌毒素[J].食品安全质量检测学报,2018,9(22):5843-5855.

[9]张大伟,高和杨,周旌,等.超高效液相色谱-串联质谱法同时检测饲料原料､饲料成品中18种真菌毒素含量[J].食品安全质量检测学报,2018,9(22):5867-5876.

[10]王瑞国,林刚,李桐,等.超高效液相色谱-串联质谱法快速检测动物饲料中5种霉菌毒素[J].食品安全质量检测学报,2019,10(11):3286-3293.