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细胞转染技术

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2024-12-01 20:58

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细胞转染技术汇报人：宋晓萍 2015.5.9 目录 1 影响转染实验的因素转染方法将外源分子如DNA，RNA等导入真核细胞的技术。细胞转染—— 研究内容：研究和控制真核细胞基因功能应用：基因功能、调控基因表达、突变分析和蛋白质生产等生物学试验常规转染技术外源 DNA 既可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游离体（episome）存在。尽管线性 DNA 比超螺旋 DNA 转入量低但整合率高。外源 DNA 整合到染色体中概率很小，大约 1/104 转染细胞能整合，通常需要通过一些选择性标记，如来氨丙基转移酶（APH；新霉素抗性基因），潮霉素 B 磷酸转移酶（HPH），胸苷激酶（TK）等反复筛选，得到稳定转染的同源细胞系。外源 DNA/RNA 不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但通常只持续几天，多用于启动子和其它调控元件的分析。一般来说，超螺旋质粒 DNA 转染效率较高，在转染后 24-72 小时内（依赖于各种不同的构建）分析结果，常常用到一些报告系统如荧光蛋白，β 半乳糖苷酶等来帮助检测。脂质体介导转染脂质体转染的原理基于电荷吸引原理，先形成脂质体-DNA复合物，散布在细胞周围，然后通过细胞的内吞作用，将目的基因导入细胞内。 1. promega公司 Promega转染试剂产品适合于人HeLa，Hep G2，293，K562，Jurkat；猴COS-7，CV-1；小鼠NIH3T3；仓鼠BHK，CHO；大鼠PC12；昆虫S19等等细胞系的RNAi转染。 2. Invitrogen公司 Lipofetamine2000，适合于Hela，BHK，HEK，COS-7，PC12，NIH3T3等各种常用细胞系的RNAi转染。 3. 转染FAQs：转染试剂的选择脂质体复合物与贴壁细胞的接触机会比悬浮细胞高出很多倍，所以，脂质体转染时悬浮细胞的转染效率要明显低于贴壁细胞。悬浮细胞是用的电穿孔法。细菌铺板：加入抗生素（终浓度是50ug/ml-100ug/ml）挑选菌落：从LB培养基上挑选菌落备用细菌培养：37摄氏度培养箱中以180rpm摇动12~14h，使大肠杆菌繁殖碱裂解抽提：采用细胞裂解的方式，从含目标质粒的大肠杆菌菌液中将质粒提取出来质粒的转化具体方法省略…… NOTE: 不同的感受态细菌转化效率不同，选择合适的E.coli 1ng的cccDNA就可使50ul的感受态细胞饱和，DNA量过多会降低转化效率。转化时为提高转化效率，质粒加入E.coli培养1h后可离心弃上清后用剩余的菌液涂布。在质粒提取过程中，由于机械力、酸碱度、试剂等的原因，可能使质粒DNA链发生断裂。所以，多数质粒粗提取物中含有三种构型的质粒：共价闭合环状DNA（超螺旋）：质粒的两条链没有断裂；开环DNA：质粒的一条链断裂；松弛的环状分子；线形DNA：质粒的两条链均断裂；线性分子 Q1：原先测序鉴定没有问题的细菌，37℃摇菌后发现质粒大小或序列出现异常? 常见问题及解决方案 Q2：未提出质粒或质粒得率较低，如何解决? 大肠杆菌老化，细菌发生溶菌，可减少培养时间或者试试平板培养，质粒拷贝数低，质粒抽提过程很大程度上是受细菌生长情况决定的，刚活化的菌比负80℃保存菌种所培养出来的菌液状态好，保存久的菌株可能会造成质粒浓度低，质粒丢失等不明原因。菌体中无质粒，质粒丢失。每次接种时应接种单菌落。另外，检查抗生素使用浓度是否正确。判断生长的菌液是否正常，可以用肉眼观察，在光线明亮处摇荡新鲜培养液，如果菌液呈漂絮状，情况很好。如果呈泥水状，即看不到絮状，则可能提不出好的质粒，或者没有质粒。碱裂解不充分，菌液不宜生长太浓，摇床速度不宜过高。吸附柱过载：质粒未全部溶解(尤其质粒较大时) ：洗脱溶解质粒时，可适当加温或延长溶解时间。乙醇残留：漂洗液洗涤后应离心尽量去除残留液体，再加入洗脱缓冲液。洗脱液加入位置不正确：洗脱液应加在硅胶膜中心部位以确保洗脱液会完全覆盖硅胶膜的表面达到最大洗脱效率。洗脱液不合适：DNA只在低盐溶液中才能被洗脱，如洗脱缓冲液或水。洗脱效率还取决于pH值，最大洗脱效率在pH7.0-8.5间。当用水洗脱时确保其pH值在此范围内，如果pH过低可能导致洗脱量低。洗脱时将灭菌蒸馏水或洗脱缓冲液加热至60℃后使用，有利于提高洗脱效率。洗脱体积太小：随着洗脱体积的增大回收率增高，但产品浓度降低。洗脱时间过短：洗脱时间对回收率也会有一定影响。洗脱时放置1min可达到较好的效果。转染方法细胞培养用品表面积（mm2/孔）细胞密度培养基（μl/孔） 96孔板 50 1.5×104-5.0×104 100μl 48