首页 > 分享 > 斑马鱼行为篇㊵：炎症性肠病相关斑马鱼模型

斑马鱼行为篇㊵：炎症性肠病相关斑马鱼模型

萌宠菠菠乐园
2024-09-23 20:10

找科研好物，来脑声工房

炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)是慢性非特异性肠道炎症性疾病，包括溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)和克罗恩病(Crohn’s disease，CD)。

用小鼠、斑马鱼、大鼠、猴和绵羊等为研究对象，已经建立多种IBD动物模型。小鼠模型作为IBD研究中最成熟的模型，从肠道共生菌群、免疫反应及遗传等方面对科学家认识IBD做出了重要贡献。但小鼠模型的局限性也不言而喻。首先，利用小鼠模型不能动态跟踪IBD的病理发展，只有在小鼠被杀死之后才能检测其病理变化。此外，小鼠2月龄左右性成熟，孕期约21天，每年产6-8胎，每胎5-10只，因此可以用于建模的数量较少，建模时间也较长。例如，使用葡聚糖硫酸钠(dextran sodium sulphate，DSS)构建IBD模型时，一般选用6—8周龄或者7-9周龄的小鼠，需要等待1.5-2个月。小鼠炎症性肠病模型的这些缺点在一定程度上不利于IBD研究的进展，而斑马鱼模型在IBD发病的遗传、分子机制以及药物筛选研究中展现出巨大的潜力，使之受到越来越广泛的关注与重视。

斑马鱼模型在炎症性肠病研究中的优势

斑马鱼中，有众多细胞特异性启动子驱动荧光蛋白表达的转基因株系，利用活体成像可以对肠道和其他组织中的细胞进行动态实时监控，这为IBD发病机制的研究提供了更好的视角。有研究利用中性粒细胞荧光报告基因斑马鱼及其幼体检测急性炎症反应，根据白细胞炎症指数对抗炎或者促炎化合物进行分类，筛选出两种具有良好抗炎作用的膳食酚酸(没食子酸以及阿魏酸)。

相对于小鼠动物模型，斑马鱼更易养殖，减少了实验支出。此外，斑马鱼三个半月即可达到性成熟，胚胎受精后5天肠道系统即发育完成;一对斑马鱼一次可产200-300颗卵，间隔4-7天，又可进行下一次交配。这为IBD药物筛选和药物测试提供充足的实验动物，大大缩短了试验周期。同时，斑马鱼胚胎透明，体外受精，直接生活在水环境中，使鱼暴露在化学物质或者微生物的实验更易于进行。除此之外，斑马鱼获得性免疫在受精后4周才发挥作用，因此，在4周之内研究先天性免疫对炎症性肠病的影响是斑马鱼作为IBD动物模型的又一优势。

斑马鱼肠道与哺乳动物肠道的相似性斑马鱼的肠道发育在受精后18小时开始，内胚层细胞开始极化，随后是节段管腔的形成，上皮细胞和基质细胞的渐进式形态发生和分化，在受精后5天肠道发育完全。这与哺乳动物肠道发育时间顺序相同，都是先发育肠的吻侧部分，随后是后肠和中肠。此外，斑马鱼前中肠段在功能上类似于哺乳动物的小肠，后段则与哺乳动物大肠具有相同的特征。同时，斑马鱼与人类有高度相似的消化系统，肝脏、胆囊、胰腺和肠道也具有类似的吸收和分泌功能。最后，斑马鱼与人类基因的同源性达70%以上，这也为利用斑马鱼模式生物研究人类肠道疾病奠定了坚实的基础。

常用的斑马鱼IBD模型

肠道上皮的作用：肠道上皮细胞最重要的作用之一是能够消化摄入的食物并吸收食物中的营养。除此之外，肠道上皮细胞中的杯状细胞、肠内分泌细胞、干细胞、潘氏细胞等紧密连接，为阻止病原体、毒素和过敏原从肠道管腔扩散到组织提供了生化和物理屏障。屏障完整性遭到破坏会强烈激活免疫细胞，引起肠道组织的慢性炎症。IBD模型正是通过不同程度的肠道屏障损伤而引发炎症进行构建的。根据模型的不同构建方式可以分为化学诱导模型、基因工程模型、细胞转移模型和基因突变模型。其中，化学诱导模型不需要进行基因筛选和繁殖传代，耗时少。处理方式主要是通过浸泡和肠道给药，易操作。所用药物易得，价格便宜，成本小。更重要的是，化学诱导模型模拟人类IBD典型临床症状的同时，也具备一些关键免疫学和组织病理学特征。因此，化学诱导模型是最常用并且应用最广泛的模型。

按照处理的化学药物不同，斑马鱼IBD模型主要有三种:唑酮诱导的IBD模型、2，4，6－三硝基苯磺酸(2，4，6-trinitrobenzene sulfonic acid，TNBS)诱导的IBD模型和葡聚糖硫酸钠(dextran sodium sulfate，DSS)诱导的IBD模型。

唑酮诱导的斑马鱼IBD模型

构建该模型最早使用的药物是半抗原唑酮，利用成年斑马鱼直肠内给药，5小时后出现症状，例如，肠皱襞破坏、杯状细胞减少、肠壁增厚、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞组成的炎症细胞浸润，并持续一周。虽然唑酮诱导的斑马鱼小肠结肠炎模型与相应的小鼠有很高的相似性，但是它的使用仅限于成年的、不透明的斑马鱼。

TNBS诱导的斑马鱼IBD模型

TNBS诱导的模型具有造模时间短、可重复、易于诱导等优点，既可以模拟急性炎症反应，也可以模拟慢性炎症反应，是经典的IBD动物模型，主要用于克罗恩病的研究。TNBS可以诱导幼年斑马鱼，也可以诱导成年斑马鱼。处理斑马鱼幼鱼时，把受精后3天的斑马鱼幼鱼浸泡在TNBS中处理五天，则出现TNBS诱导小鼠结肠炎的特征;TNBS处理成年斑马鱼时，直肠内给药，6小时后，肠内有大量中性粒细胞浸润，造成肠血管系统破坏、中肠缩短、肠蠕动消失、肠道绒毛长度缩短等。可能由于TNBS为半抗原物质，可与大分子组织蛋白结合成为抗原，引发机体免疫反应，从而导致类似于IBD的症状。Yu等用TNBS诱导的斑马鱼IBD模型，以抑制肠道中性粒细胞积累和ＲOS水平量化为筛选标准，通过质谱分析确定中药方化学成分，鉴定出主要化合物，发现其中巴马汀、大豆苷、千层纸素A－7－0－βD－葡萄糖醛酸苷、绿原酸、黄芩苷、七叶皂荚这六个化合物对肠道炎症表型表现出较强的抑制作用。

DSS诱导的斑马鱼IBD模型

用DSS处理受精后三天的斑马鱼幼体，会导致细菌过度增长，中性粒细胞渗入肠道，促炎基因上调，以及细胞增殖整体被抑制，这与肠道菌群失调及DSS破坏肠黏膜屏障有关。此模型多用于溃疡性结肠炎病理机制及筛选治疗药物方面的研究。

斑马鱼IBD模型在模拟重复肠损伤和修复方面具有突出优势，其中使用最广泛的IBD模型就是由DSS诱导的。与DSS诱导慢性小鼠IBD模型需要几个月的建模周期不同，斑马鱼中重复性DSS损伤明显不能完全恢复、死亡率增加、黏液生成受损、自噬受损，这些都在两周之内发生。

局限性：

动物模型与人类IBD疾病症状相似，但目前尚没有一种模型能够完全模拟人类IBD的发病机制。斑马鱼IBD模型也存在一定局限性:第一，IBD患者的肠道屏障受损，肠上皮细胞大量脱落，而肠上皮细胞是肠道黏膜屏障的主要组成成分，其补充需要来自肠隐窝干细胞的分化，但斑马鱼缺少隐窝结构，因此，关于肠隐窝干细胞分化为肠上皮细胞的过程和分子机制不适合利用斑马鱼模型进行研究。第二，斑马鱼和哺乳动物在T、B淋巴细胞的成熟位点和抗体亚型上也存在差异。例如，斑马鱼的B淋巴细胞是在前肾中产生的，而哺乳动物的B淋巴细胞则是在骨髓中产生的。第三，斑马鱼作为水生生物，其菌群组成与人和小鼠也有很多不同，斑马鱼的菌群主要以变形杆菌为主，而小鼠和人类的菌群以拟杆菌和厚壁菌门为主。一些生活在哺乳动物肠道中的微生物在斑马鱼肠道中无法生存，这使免疫和宿主微生物相互作用的研究存在一定的局限。

尽管斑马鱼作为IBD研究模型存在一定局限性，但斑马鱼体型小、产卵多、胚胎透明、试验周期短、成本低、基因操作技术应用方便等方面的优势，以及斑马鱼和人类在基因和免疫方面的相似性，使斑马鱼在IBD发病机制和治疗研究方面显示出巨大的价值，在通过药物筛选或免疫抑制逆转IBD患者症状的研究方面也展现出广阔的应用前景。

参考文献：

1、炎症性肠病动物模型研究进展[J]. 李时杰;牛俊坤;缪应雷.中华炎性肠病杂志,2019(01)

2、炎症性肠病动物模型的研究进展[J]. 张露丁;高文艳.现代中西医结合杂志,2017(33)

3、任玉平,张变红.斑马鱼模型在炎症性肠病研究中的应用[J].生物学教学,2023,48(04):2-4.

4、Efficacy of drugs used in the treatment of IBD and combinations thereof in acute DSS-induced colitis in mice[J]. Holger Sann;;Jasmin von Erichsen;;Manuela Hessmann;;Andreas Pahl;;Angelika Hoffmeyer.Life Sciences,2013

5、Investigating intestinal inflammation in DSS-induced model of IBD.[J]. Kim Janice J;;Shajib Md Sharif;;Manocha Marcus M;;Khan Waliul I.Journal of visualized experiments : JoVE,2012

找实验方法，上脑声常谈

方法检索教程

往期实验方法，需要的老师可以按照以下操作进行查阅：进入公众号脑声常谈→底部菜单栏脑声助手方法检索→最上方搜索框输入实验名称，您找的实验方法就出来啦！