首页 > 分享 > 斑马鱼行为篇㉕：斑马鱼糖尿病模型建立方法

斑马鱼行为篇㉕：斑马鱼糖尿病模型建立方法

萌宠菠菠乐园
2024-09-23 20:04

模式生物斑马鱼（Danio rerio）具有体积小、产卵多、可活体观察组织、监测生物进程和建模周期短等优点，且目前已完成的斑马鱼基因测序结果显示斑马鱼与人类基因同源性高达87%。此外，斑马鱼的胰腺在形态学和基因表达上与哺乳动物非常相似，其胰腺是由外分泌腺和内分泌腺两部分组成，前者分泌胰液，后者分泌胰高血糖素、胰岛素、生长抑制素和胰多肽。因此，斑马鱼可以用于糖尿病研究。斑马鱼是理想的脊椎模式生物。它的胰腺以及胰岛素作用敏感的靶组织如肝脏、肌肉等在进化上均具有保守性，而且糖代谢相关的关键机制与一些哺乳动物非常相似。斑马鱼糖代谢速度高于肉食性鱼类，其生长速度与碳水化合物含量成正比。另外，糖代谢相关的重要基因如己糖激酶等在斑马鱼体内表达活跃，而这些基因缺失会导致斑马鱼胚胎神经缺陷。因此，斑马鱼非常适用于糖代谢方面的研究，可用于糖尿病发病机制研究及其药物的研发与筛选。

1型糖尿病斑马鱼模型

1型糖尿病（type 1 diabetes mellitus）被称为胰岛素依赖性糖尿病，它主要是胰岛β细胞自身免疫性炎性反应导致β细胞破坏和功能损害，从而使胰岛素分泌缺乏。针对斑马鱼，虽然缺乏其自身免疫导致的1型糖尿病模型，但已经开发出靶向损伤β细胞的1型糖尿病模型。目前，有3种通过破坏β细胞建立1型糖尿病模型的方法：手术切除、药物诱导和转基因法。

手术切除法

手术是最早的糖尿病复制方法。早在 1689年，Johann Conrad Brunner将犬的胰腺切除后，记录了犬多饮、多食和多尿即“三多”现象；200多年后陆续有学者将胰腺与糖尿病联系起来，并证明手术切除胰腺可诱发糖尿病。由于斑马鱼的胰腺较小且弥散性分布在肝脏、胆囊和肠道周围，为此很难将胰腺完全切除。因此，通过手术切除法建立斑马鱼糖尿病模型对研究者的操作技术和设备要求较高，不常用于斑马鱼。

药物诱导法

啮齿动物糖尿病模型的构建普遍用化学药物诱导。常用的化学药物有四氧嘧啶（alloxan）和链脲佐菌素（streptozotocin），它们均可使β细胞凋亡，造成胰岛素分泌不足，血糖升高。四氧嘧啶处理受精斑马鱼胚胎后，胚胎中胰岛变小，且近一半的斑马鱼胚胎死亡，说明四氧嘧啶具有一定毒性。另外，通过腹腔注射剂量为350 mg/kg的链脲佐菌素构建了1型糖尿病成年斑马鱼模型，为了使斑马鱼处于高血糖状态，需多次腹腔注射链脲佐菌素。链脲佐菌素诱导的斑马鱼糖尿病模型不仅空腹血糖升高，胰岛素表达水平降低，且出现糖尿病并发症，如糖尿病肾病和尾鳍再生障碍等。与四氧嘧啶相比，链脲佐菌素的组织毒性相对较小；而四氧嘧啶可致肝肾功能损害，建模死亡率较高。总之，化学药物诱导糖尿病模型的方法操作简单，可行性较高。

转基因法

一种转基因斑马鱼Tg（HS4-sst2:CFP; ins:PhiYFP-m-dest1-2TA-nfsB）lmcoo9，简称ins:NTR。ins:NTR斑马鱼的胰岛β细胞中表达绿色荧光蛋白和硝基还原酶，硝基还原酶可使甲硝唑（metronidazole）转化为细胞毒素，破坏胰岛β细胞。该转基因斑马鱼经腹腔注射甲硝唑3d后，99.7%的β细胞损伤，但α细胞不损伤，斑马鱼出现高血糖；甲硝唑注射5～7d后，β细胞数量开始增加，两周后血糖恢复正常，推测可能是由于斑马鱼再生能力强，胰岛内单细胞增殖和分化使得β细胞再生。

2型糖尿病斑马鱼模型

2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus）受多种环境因素的诱导，主要特点是胰岛素抵抗和胰岛素分泌相对缺乏。胰岛素抵抗被认为是2型糖尿病的主要驱动因素，主要是胰岛素对其靶器官敏感性下降，表现为肌肉、肝脏和脂肪等胰岛素靶组织对葡萄糖利用出现障碍，导致葡萄糖滞留在血液中。在发病早期，胰岛素与其靶细胞亲和力下降，需要β细胞分泌和释放更多的胰岛素，引发胰高血糖素血症，如此形成糖代谢紊乱和β细胞功能不足的恶性循环，最终导致β细胞功能严重缺陷，引发2型糖尿病。2型糖尿病的动物模型有自发性动物模型、诱发性动物模型和转基因模型等。斑马鱼2型糖尿病模型的构建方法主要有3种：葡萄糖浸泡法、饮食诱导法和基因敲除法。

葡萄糖浸泡法

成年斑马鱼能够调节其体内水分和总溶质浓度，且4～11月龄成年斑马鱼经葡萄糖刺激的效果优于1～3年成年斑马鱼。斑马鱼一般饲养在水温为（28 ± 2）℃、明暗周期为14 h/10 h的水循环系统中，正常喂食商用饲料或孵化好的丰年虾。葡萄糖浸泡法有两种方案：用2 %的葡萄糖溶液连续浸泡14 d；隔天浸泡2%葡萄糖溶液，培养28～30 d。葡萄糖浸泡3～7 d 后，斑马鱼体内血糖水平明显上升。两种方案进行对比发现，前者的优点在于造模所需时间短，血糖相对稳定，而缺点是会有20%的斑马鱼死亡。葡萄糖浸泡法可导致糖尿病并发症如视网膜病变，因此可用于糖尿病视网膜病变研究。另外，模式生物斑马鱼具有产卵多、胚胎透明的优点，将受精5d后的斑马鱼幼鱼给予3%葡萄糖浸泡联合高脂饮食，10d即可得到2型糖尿病模型，非常适用于糖尿病药物的研发与筛选。

饮食诱导法

流行病学调查结果显示，肥胖容易引起高胰岛素血症和胰岛素抵抗，也是发生2 型糖尿病的重要危险因素。在啮齿动物模型中，高脂肪饮食同时导致肥胖和2型糖尿病。对成年斑马鱼过度喂食，结合高脂饮食饲养，获得2型糖尿病斑马鱼模型：模型组10周内每天每只喂食60 mg丰年虾和1% 新鲜蛋黄液，10周后检测发现该模型的血糖、脂质表达和体质指数均升高，肝脏、肌肉和大脑出现胰岛素基因高表达，且肝脏中胰岛素受体底物2与葡萄糖转运蛋白2的基因表达降低，这些表现与肥胖斑马鱼模型相似。还可通过过度喂食得到饮食诱导肥胖（diet-induced obesity，DIO）的斑马鱼。

基因敲除法

胰岛素抵抗主要是胰岛素与其作用的靶器官敏感性下降，因此敲低靶器官中胰岛素受体（insulin receptor，INSR）基因表达可导致血糖升高。随着斑马鱼年龄的增加，β细胞数目减少，出现葡萄糖耐受性差，空腹血糖升高。另外，有研究利用成簇的规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白9技术敲降斑马鱼肝脏中 INSR活性，可导致空腹低血糖和餐后高血糖。其中 INSRA-/-斑马鱼餐后血糖升高程度远高于INSRB-/-斑马鱼，而且发现INSRA-/-斑马鱼在抑制糖异生和刺激糖酵解时出现障碍，而 INSRB-/-斑马鱼在刺激糖酵解方面也存在严重缺陷，提示 INSRA和INSRB在维持斑马鱼稳态方面具有重叠和多样化的功能。

参考文献

1、Relationships between the duration of illness and the current status of diabetes in elderly patients with type 2 diabetes mellitus[J]. Hiroyuki Ito;;Takashi Omoto;;Mariko Abe;;Suzuko Matsumoto;;Masahiro Shinozaki;;Shinya Nishio;;Shinichi Antoku;;Mizuo Mifune;;Michiko Togane.Geriatrics & Gerontology International,2017(1)

2、High glucose‐induced changes in hyaloid‐retinal vessels during early ocular development of zebrafish: a short‐term animal model of diabetic retinopathy[J]. Seung‐Hyun Jung;;Young Sook Kim;;Yu‐Ri Lee;;Jin Sook Kim.British Journal of Pharmacology,2016(1)

3、Centroacinar Cells Are Progenitors That Contribute to Endocrine Pancreas Regeneration[J]. Delaspre, Fabien;;Beer, Rebecca L;;Rovira, Meritxell;;Huang, Wei;;Wang, Guangliang;;Gee, Stephen;;Vitery, Maria del Carmen;;Wheelan, Sarah J;;Parsons, Michael J.Diabetes,2015(10)

4、Multiplex Conditional Mutagenesis Using Transgenic Expression of Cas9 and sgRNAs[J]. Yin, Linlin;;Maddison, Lisette A;;Li, Mingyu;;Kara, Nergis;;LaFave, Matthew C;;Varshney, Gaurav K;;Burgess, Shawn M;;Patton, James G;;Chen, Wenbiao.Genetics,2015(2)

5、江霞,钱豪杰,魏迅等.斑马鱼糖尿病模型的构建及应用进展[J].实验动物与比较医学,2020,40(06):547-552.

6、Persistent impaired glucose metabolism in a zebrafish hyperglycemia model[J]. Katiucia Marques Capiotti;;Régis Antonioli;;Luiza Wilges Kist;;Maurício Reis Bogo;;Carla Denise Bonan;;Rosane Souza Da Silva.Comparative Biochemistry and Physiology, Part B,2014

找实验方法，上脑声常谈

方法检索教程

往期实验方法，需要的老师可以按照以下操作进行查阅：进入公众号脑声常谈→底部菜单栏脑声助手方法检索→最上方搜索框输入实验名称，您找的实验方法就出来啦！