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斑马鱼行为篇㊺：斑马鱼上的在体电生理记录

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2024-09-23 20:20

斑马鱼作为一种相对新颖的模式脊椎动物，具有保守的神经系统和丰富的行为模式。近年来随着在体电生理、在体成像等技术的发展，幼龄斑马鱼因其脑部透明、结构简单等特点，已成为从微观到宏观等多层次，在全脑尺度上研究脑功能的理想动物模型。依托咪酯(etomidate)，作为一种全身静脉麻醉药被广泛应用于临床，其主要是通过激活A型γ-氨基丁酸受体(GABAA受体)而引起镇静催眠的效果。从行为到电生理(包括在体场电位记录和全细胞记录)水平上建立依托咪酯斑马鱼麻醉模型，建立斑马鱼全麻模型可在体水平上探究全身麻醉药作用的突触和神经环路机制。视顶盖位于斑马鱼的中脑，是斑马鱼中枢神经系统中最大的脑区，其主要处理视觉信息，同时也整合听觉和嗅觉等其它感觉信息。LFP反应群体神经元的电活动。通过对顶盖区进行LFP的记录可观察大脑电活动的情况。

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使用斑马鱼为野生型(wild type,WT)斑马鱼，斑马鱼饲养环境为14h:10h暗，饲养水温为28.5℃，pH7~8，养殖系统采用北京爱生公司的水生模式动物养殖系统。发育成熟的斑马鱼在实验前一天晚上按雌雄1:1进行交配，第2天中午收集受精卵，并置于28.5℃培养箱用系统水孵化。行为及电生理实验均选用5~6天幼年斑马鱼。

行为学实验全身麻醉过程主要包括麻醉诱导、维持以及苏醒阶段。麻醉诱导时间判断：麻醉诱导时间指的是从麻醉药应用开始到进入麻醉状态所需时间。在加入依托咪酯后，用无齿镊每隔5s触碰动物尾部给予机械刺激，直到连续6次均无反应，则将第一次无反应的时间点作为“麻醉诱导时间”。麻醉苏醒时间判断：将斑马鱼随机放入24孔板中，并在每个孔中放入1mL的系统水；后将24孔板放置于ViewPoint斑马鱼行为记录仪下，记录每个斑马鱼运动轨迹，每隔5min为一个时间段生成运动路程。麻醉2h后用系统水洗脱3次，并重新加入系统水1mL。斑马鱼在连续3个时间段均有运动出现，则将第一次出现运动的时间点作为“麻醉苏醒时间”。

在体电生理记录

挑选5~6天发育正常的斑马鱼，使用含0.1%神经肌肉接头乙酰胆碱受体的阻断剂α-银环蛇毒素(α-bungarotoxin)的细胞外液，浸泡10~15min。待斑马鱼完全麻痹后，转移到记录槽中，用1.2%低熔点琼脂糖固定。等琼脂糖完全凝固后，加入细胞外液，然后在高倍体视镜下用玻璃电极剥去视顶盖上方的琼脂糖，再解剖神经元上方20~50µm皮肤，暴露下方神经元。全细胞记录使用电极通过三步拉制法，尖端外直径约为1μm，灌入电极内液后阻抗约为20~30MΩ。灌入电极内液后阻抗为5~7MΩ。运动神经元胞外记录所用电极通过五部拉制法，尖端外直径约为20μm。

LFP记录：将电极移至待记录脑区，然后通过微操调整电极位置。采样频率为15kHz，高通滤波为0.2Hz，低通滤波为100Hz。脊髓运动神经元胞外记录：所记部位为第10~20段肌节。将电极放置于肌节交界处，给以负压轻吸，使部分肌组织吸入电极内。采样频率为15kHz，高通滤波为300Hz，低通滤波为1000Hz。全细胞记录：电极移至待记录脑区，然后通过微操调整电极位置。待电极贴近细胞，形成高阻抗封接，通过吸管给予一强而短促的负压使电极尖端封接的细胞膜破裂，从而形成全细胞记录模式。采样频率为10kHz，低通滤波为10kHz。信号通过MultiClamp700B放大器进行采集。LFP、运动神经元胞外记录及顶盖神经元的全细胞记录均先记录5min的电活动作为对照，之后将含依托咪酯外液以2mL/min速度通过恒流泵灌流入记录槽，灌流过程中持续进行电生理记录。

光刺激系统

通过LED给予2s的全场白光。LED置于离斑马鱼约20cm处，用Master8精确控制刺激模式，包括给光时间和间隔。

依托咪酯抑制斑马鱼局部场电位和视顶盖神经元的光反应以及自发活动

运用在体LFP记录方法灌流30μmol/L 依托咪酯，20 min后可完全抑制中枢神经系统的自发 LFP。表明依托咪酯可有效阻断斑马鱼大脑群体神经元的活动。

参考文献：

1、Visual Input Modulates Audiomotor Function via Hypothalamic Dopaminergic Neurons through a Cooperative Mechanism[J]. Yu Mu;;Xiao-quan Li;;Bo Zhang;;Jiu-lin Du.Neuron,2012(4)

2、General Anesthesia and Altered States of Arousal: A Systems Neuroscience Analysis[J]. Emery N. Brown;;Patrick L. Purdon;;Christa J. Van Dort.Annual Review of Neuroscience,2011

3、Sevoflurane Directly Excites Locus Coeruleus Neurons of Rats[J]. Yutaka Yasui;;Eiji Masaki;;Fusao Kato.Anesthesiology,2007(6)

4、依托咪酯对新生大鼠离体脊髓运动神经元下行激活的影响[J]. 郑超;汪萌芽.生理学报,2012(02)

5、杜文杰,杜久林,喻田.斑马鱼依托咪酯麻醉模型的建立[J].生理学报,2016,68(03):301-305.

6、Zebrafish models for translational neuroscience research: from tank to bedside[J]. Adam Michael Stewart;;Oliver Braubach;;Jan Spitsbergen;;Robert Gerlai;;Allan V. Kalueff.Trends in Neurosciences,2014

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