首页 > 分享 > 斑马鱼行为篇：斑马鱼模型研究主动脉

斑马鱼行为篇：斑马鱼模型研究主动脉

萌宠菠菠乐园
2024-09-23 20:02

斑马鱼（Zebrafish，Daniorerio）是应用广泛的脊椎类模式生物，所有斑马鱼基因中有69％与人类的基因具有明显的同源性，82%的基因与人类的致病基因具有同源性。尽管斑马鱼属于水生生物，但斑马鱼的生理构造和功能与人类相似，且斑马鱼具有养殖方便、繁殖周期短、产卵量大、胚胎体外受精、体外发育、胚体透明等优势，已经被广泛应用于发育生物学研究、人类疾病模型研究、新药筛选、药物毒性与安全性评价以及环境毒理性研究等领域。利用斑马鱼主动脉透明易于观察的特点，对斑马鱼胚胎进行药物处理之后，观察其主动脉的形态变化。斑马鱼是应用广泛的脊椎类模式生物，其血管生理构造和功能与人类相似，且主动脉透明易于观察，非常适合研究药物对于血管的影响。

斑马鱼的血管发育血管网络的正确形成对于胚胎的存活至关重要，因此脉管系统是脊椎动物胚胎最早发育起来的器官系统之一。在整个进化过程中，斑马鱼的血管解剖结构与人类的血管解剖结构具有高度的结构同源性，控制斑马鱼与人类内皮细胞发育的遗传机制已经非常保守，所以斑马鱼是开展有关心血管方面研究的理想动物模型。血管的发育是一个连续的过程，它必须满足胚胎发育不断变化的生理要求，为组织提供氧气和营养，所以斑马鱼的血管发育很快，在受精后12小时（12hpf，12hourspostfertilization）血管开始发育。其中背部主动脉（DA）在受精后22–23hpf形成，而后主静脉（PCV）的祖细胞和原始红细胞仍混合在一起。直到大约26hpf时，循环开始建立，原始红细胞开始离开中间细胞群（ICM）进入循环，循环回路建立，后主静脉才慢慢形成。节段间血管（ISVs），也被称为节段间动脉（ISAs），从大约23hpf开始从背部主动脉周围生成血管，到28hpf时形成。这样，初级血液循环在斑马鱼胚胎中迅速建立起来。由于斑马鱼体积较小，氧气和营养容易通过扩散满足存活需求，即使在没有血液循环的情况下，斑马鱼也可以存活好几天，所以斑马鱼比较适合研究药物对血管的影响。

2.5dpf双转基因斑马鱼胚胎的血管系统

药物处理后观察斑马鱼主动脉的形态变化：

1、第一天下午，将转基因斑马鱼Tg(flk:EGFP)，以雌鱼和雄鱼1：1或者2：1的比例置于交配缸中，过夜。

2、第二天上午，将交配缸中雌鱼和雄鱼之间的透明挡板拔掉，雌鱼和雄鱼开始交配。1-2个小时之后，交配缸的底部有大量圆圆的且透明的胚胎时，将胚胎收集起来，置于28.5℃的培养箱中培养。注意要及时挑除发育不正常的胚胎。

3、在大约24hpf时，将培养胚胎的普通水换成1xPTU，目的是防止胚胎长黑色素，影响实验观察。

4、在2dpf时，将生长时期较为一致的正常胚胎分到12孔板里面，每个孔放入10条鱼，并加上配制好的药物，2mL/孔。

5、药物处理24h后，在体式显微镜下观察胚胎的状态，并且在正置荧光显微镜下观察胚胎的主动脉的形态变化。

6、药物处理48h后的操作，与药物处理24h后的操作相同。

斑马鱼冰冻切片：

1、固定胚胎：将胚胎浸泡在4%组织固定液中，过夜。固定后，用PBS洗3次，每次10分钟。2、使用前将切片机箱体温度调至-15℃，载物台温度调至-17℃，关闭天窗预冷至少30min。同时将刀片和毛笔也一起放入载物台里预冷。

3、包埋胚胎：用锡箔纸缠绕细毛笔一周，双面胶黏住锡箔纸切面，形成一个圆柱体，这个圆柱体模具底面积为毛笔的横截面积，高为1cm。将冰冻切片包埋剂涂在支架圆盘表面，将模具竖直放在支架中央后，将带有模具的支架竖直放入提前预冷好的冰冻切片机内冷冻，使模具与支架牢牢地冻在一起。随后，将模具取出，向模具中填充包埋剂（避免产生气泡）。最后，用头发丝将胚胎从PBS中挑进包埋剂，使其头部向上、尾部向下，在冰冻切片机中冷冻数分钟。此时，应该准备好多聚赖氨酸包被过的载玻片，置于室温。

4、切片：用镊子小心地剥去圆柱体最上面0.5cm的锡箔纸，将支架固定在冰冻切片机的载物台上，调节切片厚度为20μm。切片之前，需要用毛笔，清理刀刃以及玻璃房卷板边缘，防止有碎屑干扰。调节玻璃防卷板的位置，使得切片完整。胚胎是否竖直摆放可以首先通过左、右两只眼睛是否对称来判断。慢慢地切下一张切片（不能连续切片），打开防卷板，快速地黏在玻片上，在倒置显微镜下观察。确认胚胎竖直后，可以快速切片，随后可以每隔三片观察位置，在到达主动脉段时就可以进行收样。将贴有切片的玻片放置37℃烘箱3h，使得切片可以更紧密地黏在玻片上。-20℃冰箱可长期保存样品。

拍照：

1、药物处理后斑马鱼胚胎的整体形态用宏观变倍荧光显微镜拍照。

2、药物处理后斑马鱼胚胎主动脉的形态变化用双光子激光共聚焦显微镜拍照。将药物处理后的胚胎取出，用1x麻醉剂进行麻醉，待鱼没有明显的乱动之后，将其固定于已经冷却的1.5%低熔点琼脂糖里面，摆放到合适的角度，待低熔点琼脂糖凝固即可拍照。

3、冰冻切片样品用双光子激光共聚焦显微镜拍照。将样品从-20℃冰箱拿出，清洗样品上面的包埋剂，PBS室温洗3次，每次10分钟，注意吸取和清洗动作都要轻柔，防止样品脱落。吸干样品上面的PBS，封片剂封片后，即可拍照，观察药物处理后的斑马鱼胚胎主动脉的管腔变化。

斑马鱼透射电子显微镜成像：

1、将经过药物处理的Tg（flk:EGFP）斑马鱼胚胎放置在装有4%组织固定液的培养皿中。快速将胚胎的首尾去掉，保留主动脉段。

2、将主动脉段立即放入装有4℃预冷的固定液的1.5毫升EP管，4℃过夜。

3、将主动脉段用PBS洗4次，每次15分钟。

4、将主动脉段置于锇酸中固定1.5小时（注意：剧毒品，需在通风橱进行操作）。

5、将主动脉段用PBS洗6次，每次15分钟（注意：若清洗不干净，会影响后期结果观察，在通风橱中进行操作）。

6、将主动脉段进行50%、70%、80%、90%、100%梯度乙醇脱水，每级10分钟（注意：乙醇需用之前现配且预冷，在通风橱中进行操作）。

7、将主动脉段置于丙酮中清洗两次，每次10分钟。

8、将主动脉段置于丙酮和树脂比例为1:1的混合液中，2-4小时。

9、将主动脉段置于纯树脂中，室温过夜；第二天，纯树脂继续渗透12小时。

10、样品包埋：用环氧树脂将胚胎样品包埋在包埋板里，使其头部向上尾部向下竖直放置。

11、将样品40℃渗透聚合24小时，60℃聚合24小时

12、用修块机修块，将样品暴露出来，半薄切片，厚度1-2微米。染色，光镜下观察细胞状态。再次精细修块，进行超薄切片。最后染色（铀和铅双染）。

13、透射电镜观察并拍照。

参考文献：

1、The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.[J]. Howe Kerstin;;Clark Matthew D;;Torroja Carlos F;;Torrance James;;Berthelot Camille;;Muffato Matthieu;;Collins John E;;Humphray Sean;;McLaren Karen;;Matthews Lucy;;McLaren Stuart;;Sealy Ian;;Caccamo Mario;;Churcher Carol;;Scott Carol;;Barrett Jeffrey C;;Koch Romke;;Rauch Gerd-Jörg;;White Simon;;Chow William;;Kilian Britt;;Quintais Leonor T;;Guerra-Assunção José A;;Zhou Yi;;Gu Yong;;Yen Jennifer;;Vogel Jan-Hinnerk;;Eyre Tina;;Redmond Seth;;Banerjee Ruby;;Chi Jianxiang;;Fu Beiyuan;;Langley Elizabeth;;Maguire S.Nature,2013

2、晋攀.利用斑马鱼模型评价TKI类药物对主动脉的影响[D].广州医科大学,2021.

找实验方法，上脑声常谈

斑马鱼行为实验交流群

扫码邀请入群